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骨碎补总黄酮对纳米羟基磷灰石-胶原复合材料与成骨细胞-血管内皮细胞共培养体系中血管内皮细胞增殖的影响

李晋玉  俞兴  姜俊杰  赵学千  孙旗  郑晨颖  白春晓  刘楚吟  贾育松  
【摘要】:目的:探讨骨碎补总黄酮(osteopractic total flavone,OTF)对纳米羟基磷灰石-胶原(nano-hydroxyapatite collagen,nHAC)复合材料与成骨细胞-血管内皮细胞共培养体系中血管内皮细胞增殖的影响。方法:分别以浓度为500μg·mL~(-1)、250μg·mL~(-1)、100μg·mL~(-1)、50μg·mL~(-1)及0μg·mL~(-1)的OTF溶液干预生长在nHAC复合材料上的hFOB1.19人成骨细胞,干预24 h后收集5种上清液。再分别以5种上清液和人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)培养基混合培养HUVEC,培养24 h和48 h后进行划痕实验,计算细胞迁移率,确定OTF溶液最佳干预浓度和时间。在4个培养皿中铺满nHAC复合材料,加入DMEM/F12。A培养皿中不添加其他材料;B、D培养皿中接种hFOB1.19人成骨细胞,预培养24 h使细胞贴壁;C、D培养皿中加入OTF溶液,根据上一步划痕实验确定的最佳干预浓度和时间进行干预。干预结束后收集各培养皿中的上清液进行后续实验。接种HUVEC于HUVEC培养基上,分为空白组和A、B、C、D共5组;空白组不添加其他材料,A、B、C、D组分别加入A、B、C、D培养皿上清液;以CCK-8法测定细胞增殖率,HE染色后观察HUVEC形态,以ELISA法检测血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)含量。结果:①OTF溶液最佳干预浓度与时间检测结果。5种浓度OTF溶液干预后,0~24 h细胞迁移率的差异有统计学意义[(16.46±4.01)%,(21.71±1.30)%,(24.94±3.47)%,(22.08±2.46)%,(21.34±2.28)%,F=4.564,P=0.013],其中100μg·mL~(-1)OTF溶液干预后的细胞迁移率高于其余4组(P=0.001,P=0.020,P=0.014,P=0.029);24~48 h细胞迁移率的差异无统计学意义[(6.06±1.22)%,(5.37±1.85)%,(5.58±1.88)%,(6.14±1.52)%,(4.99±1.25)%,F=0.374,P=0.823]。提示OTF溶液最佳干预浓度为100μg·mL~(-1),最佳干预时间为24 h。②HUVEC细胞活性检测结果。时间因素与分组因素存在交互效应(F=14.039,P=0.000);5组HUVEC细胞增殖率总体比较,差异有统计学意义,即存在分组效应(F=83.285,P=0.000);干预开始后不同时点之间HUVEC细胞增殖率的差异有统计学意义,即存在时间效应(F=1 968.467,P=0.000);5组HUVEC细胞增殖率随时间变化均呈升高趋势,各组的变化趋势不完全相同(1.05±0.06,1.81±0.09,2.53±0.05,6.10±0.17,11.29±1.21,F=527.347,P=0.000;0.99±0.11,2.37±0.40,2.92±0.19,7.35±0.19,14.41±1.35,F=913.030,P=0.000;0.98±0.20,3.50±0.18,4.35±0.16,8.53±0.99,15.42±0.73,F=1 637.304,P=0.000;1.02±0.10,2.10±0.13,2.59±0.15,4.70±0.25,11.41±1.21,F=494.876,P=0.000;1.01±0.06,2.81±0.37,3.31±0.08,5.95±0.24,12.74±2.03,F=878.982,P=0.000);干预开始后0 d时,各组细胞增殖率比较,差异无统计学意义;干预开始后1 d、2 d时,B组HUVEC细胞增殖率最高、D组次之,其余3组增殖率较为接近;干预开始后3 d、4 d时,B组HUVEC细胞增殖率最高、A组次之,其余3组增殖率较为接近。③HUVEC形态观察结果。细胞形态观察结果显示,干预开始后0 d、1 d、2 d、3 d、4 d时各组HUVEC的形态均无明显差异。④VEGF和FGF-2含量检测。A、B、C、D 4组VEGF含量比较,差异无统计学意义(0.059±0.012,0.057±0.016,0.059±0.018,0.057±0.014,F=0.060,P=0.980)。4组FGF-2含量比较,差异有统计学意义[(215.83±19.56)pg·mL~(-1),(565.83±47.14)pg·mL~(-1),(228.33±17.67)pg·mL~(-1),(445.00±17.69)pg·mL~(-1),F=317.377,P=0.000];B组的FGF-2含量高于其余3组(P=0.009,P=0.010,P=0.025),D组的FGF-2含量高于A组和C组(P=0.013,P=0.017),A组和C组FGF-2含量的差异无统计学意义(P=0.050)。结论:人成骨细胞和HUVEC在nHAC复合材料上共培养,均可以良好贴附、生长和增殖;OTF不能促进nHAC复合材料与人成骨细胞-HUVEC共培养体系中HUVEC增殖;HUVEC的增殖可能与成骨细胞分泌FGF-2有关。

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