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凋亡蛋白抑制因子Livin shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

焦伊胜  王永来  张淑兰  王桂玲  
【摘要】:目的构建并鉴定凋亡蛋白抑制因子Livin基因短发夹状干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,以便进一步研究Livin的功能。方法针对已经筛选确定的Livin基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaI和XhoI酶切后的pGCL-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接、转化,产生pLV-shLivin慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLV-shLivin,pHelper1.0和pHelper2.03种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR和测序证实,成功构建Livin shRNA的慢病毒载体LV-shLivin。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为3×108TU/ML。结论成功构建Livin基因shRNA慢病毒载体,为应用RNAi研究Livin功能奠定基础。

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