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3D生物打印脂肪来源干细胞联合甲基丙烯酰化明胶构建组织工程软骨的实验研究

穆琳  曾今实  黄元亮  林燕娴  蒋海越  滕利  
【摘要】:目的探索3D生物打印脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)联合甲基丙烯酰化明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)构建组织工程软骨的可行性。方法取脂肪抽吸手术患者自愿捐赠的脂肪组织分离培养人ADSCs(human ADSCs,hADSCs),取第3代细胞与GelMA水凝胶和光引发剂混匀制成生物墨水。采用3D生物打印技术制备hADSCs-GelMA复合支架,行大体观察,于培养1 d及成软骨诱导培养14 d行扫描电镜观察;培养1、4、7 d取复合支架,行活/死细胞染色观察各时间点细胞存活率,并采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖情况;取成软骨诱导培养14 d的复合支架样本为实验组,以用完全培养基培养14 d的复合支架为对照组,行实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测软骨基质基因蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)、成软骨调节因子SOX9、软骨特异性基因Ⅱ型胶原蛋白(collagen typeⅡA1,COLⅡA1)、软骨肥大标志基因Ⅹ型胶原蛋白(collagen typeⅩA1,COLⅩA1)mRNA的相对表达量。将成软骨诱导培养14 d的3D生物打印hADSCs-GelMA复合支架(实验组)和不含细胞的空白GelMA水凝胶支架(对照组)分别植入裸鼠背部皮下两侧囊袋内,4周后取材,行大体观察、番红O染色、阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察复合支架体内成软骨情况。结果大体观察和扫描电镜观察示hADSCs-GelMA复合支架形态稳定,结构规则。培养1、4、7 d细胞存活率维持在80%~90%,各时间点间差异均有统计学意义(P0.05)。CCK-8法检测示随培养时间延长,复合支架内细胞呈持续增殖状态。对复合支架行成软骨诱导培养14 d后qRTPCR检测示,ACAN、SOX9和COLⅡA1表达显著上调,COLⅩA1表达显著下调(P0.05)。复合支架植入裸鼠体内4周后取材,网格状形态清晰完整,组织学及免疫组织化学染色示实验组软骨基质和Ⅱ型胶原沉积,可见软骨陷窝形成,提示有软骨组织形成。结论 3D生物打印的hADSCs-GelMA复合支架具备稳定的三维结构,细胞存活率高,可在体内、外诱导分化为软骨组织,可用于体内外构建组织工程软骨。

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