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苹果N-乙酰基-5-羟色胺-O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达

吴成成  李保华  练森  梁文星  王彩霞  
【摘要】:以‘富士’和‘嘎啦’苹果(Malus pumila)叶片总RNA为模板,利用反转录PCR(RT-PCR)技术,克隆N-乙酰基-5-羟色胺-O-甲基转移酶(ASMT)基因,通过DNAMAN、MEGA 5.1、Prot Param等生物信息学软件对基因cDNA序列、系统进化关系、理化性质等进行分析,将克隆的苹果ASMT基因与表达载体pET32a连接,构建原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌株Rosetta(DE3)中,优化原核表达条件,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测融合蛋白的可溶性,用蛋白免疫印迹法(western blot)和酶活性测定验证目的蛋白的表达。结果表明,获得了苹果ASMT的全长cDNA序列,命名为MpASMT1(Gen Bank登记号MF135479)。该基因开放阅读框(ORF)为1 077 bp,编码358个氨基酸。MpASMT1编码蛋白的理论分子量约为39.7 kDa,等电点为5.42,是非分泌型、疏水的稳定蛋白;其263位组氨酸(His)为催化位点,225位谷氨酸为底物S-腺苷甲硫氨酸结合位点。多序列比对及系统发生树分析表明,MpASMT1编码的氨基酸序列与珠美海棠(M.zumi)MzASMT1(KJ123721)同源性最高,相似性达99.2%,其次为葡萄(Vitis vinifera)ASMT(LOC100248671),氨基酸序列相似性为66.4%。原核表达结果显示,经0.25~2.0 mmol·L~(-1)异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的重组质粒可特异性表达分子量约58 kDa的融合蛋白,且低温条件(15和25°C)能够提高该蛋白的可溶性表达;western blot分析表明融合表达蛋白能与His单克隆抗体特异性结合,纯化蛋白的酶活性为7.8 pmol·mg~(-1)(蛋白),进一步证实MpASMT1编码蛋白成功表达。

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