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牛纽布病毒Taq Man荧光定量RTGPCR检测方法的建立及应用

赵润涛  王旭芬  侯琳  张贺  赵洋  张志丹  周伟光  
【摘要】:牛纽布病毒(Bovine nebovirus,BNeV)是国内近几年发现的引起犊牛腹泻的新病原,为了建立快速、准确且能定量分析BNeV的检测方法,本试验根据GenBank上发布的BNeV聚合酶基因(RdRp)序列设计合成了1对特异性引物和1条探针,并通过优化反应体系,成功建立了BNeV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并对临床样品进行了检测。结果表示,该方法最佳上下游引物浓度均为500 nmol/L,探针浓度为400 nmol/L,在1×10~8~1×10~1拷贝/μL之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R~2=0.996,扩增效率为105.9%;该方法特异性较强,在多个犊牛腹泻相关病原中,只检测出BNeV;敏感性较高,对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10~1拷贝/μL,而普通PCR对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10~3拷贝/μL;重复性较好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%;对2021年3~5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BNeV的检出率为35.1%,通过标准曲线计算其病毒载量,其中腹泻粪样平均病毒载量为8.7×10~5拷贝/μL。本研究建立的BNeV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的特异性强、稳定性好、灵敏度高,为BNeV的检测和分子流行病学调查提供了有力的手段

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