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p15在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

艾永兴  肖昌  郝军元  胡薇  潘风光  郑梅竹  张玉静  
【摘要】:为探讨鸡p15蛋白的特性及其在细胞周期抑制通路中与其他蛋白的作用,本研究选用昆虫细胞表达系统来表达有活性的p15蛋白。为后期纯化的需要,对pFAST供体质粒的多克隆位点进行了重新改造,并成功构建带有TAP纯化标签的供体质粒pFAST-NMCS-N-TAP-p15和pFAST-NMCS-C-TAP-p15。将2个供体质粒转化到DH10Bac感受态菌中,对阳性转化子Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15进行反复涂板的去阴性单克隆纯化,提取大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15并进行转座鉴定。将纯化的大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15转染入sf9昆虫细胞中,72h后收集培养上清中的杆状病毒,并进行病毒的扩增和滴度测定,结果所获2株重组杆状病毒N-TAP-p15和C-TAP-p15的滴度分别为3.6×107,5.4×107pfu/mL。将2株高滴度的重组杆状病毒再感染新培养的sf9昆虫细胞进行重组p15蛋白的表达,结果与对照组相比,重组p15融合蛋白得到了有效的表达,表达量分别为4.32%和4.7%。Western blotting结果表明,所表达的重组p15融合蛋白只特异地与p15单克隆抗体和兔的IgG反应而未与其他细胞蛋白反应;说明带有TAP标签的重组p15融合蛋白在昆虫细胞表达系统中得到了有效表达。

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