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骨形成蛋白7能减轻TGF-β1诱导的人足细胞损伤

陈利群  吕智美  葛俭俭  余心逸  甘华  
【摘要】:目的:观察骨形成蛋白(bone morphogenie protein 7,BMP-7)抑制转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的人足细胞转分化作用及其机制研究。方法:构建及鉴定pc DNA 3.1rh BMP-7质粒,体外培养人足细胞,先后予10、20、50、100、200μg/m L重组的BMP-7诱导足细胞,分别在培养24、48、72 h收集细胞,流式细胞试验检测细胞凋亡率,以此选择重组BMP-7最适的刺激浓度和最适的作用时间点。实验分为正常对照组、TGF-β诱导组(TGF-β)及质粒转染组(PEGF-BMP-7),质粒转染组加入重组BMP-7 100μg/m L预处理48 h后,而TGF-β诱导组和PEGF-BMP-7组分别予5 ng/m L TGF-β1处理足细胞后,通过免疫荧光观察足细胞Podocin、α-SMA、VIM的表达变化;收集细胞抽取总RNA和总蛋白,应用RT-PCR和Western blot观察重组BMP-7对人足细胞Podocin、α-SMA、VIM的m RNA和蛋白表达的影响。结果:(1)本实验成功构建pc DNA 3.1rh BMP-7质粒,转染的人足细胞能稳定表达BMP-7,质粒转染组BMP-7蛋白表达水平(0.487±0.012)较正常对照组(0.251±0.012)和TGF-β诱导组(0.151±0.015)明显增高(P0.001);(2)Real-time PCR检测结果显示TGF-β诱导组足细胞Podocin的m RNA表达水平(0.285±0.013)较正常对照组(1.057±0.090)明显降低(P0.001),而质粒转染组足细胞Podocin的m RNA表达水平(0.693±0.077)较TGF-β诱导组有升高趋势(P=0.003);TGF-β诱导组和质粒转染组足细胞的α-SMA(1.257±0.039和1.028±0.093)、VIM(1.114±0.097和0.821±0.059)的m RNA表达较正常对照组(0.357±0.089和0.403±0.020)明显升高(P0.001),质粒转染组足细胞α-SMA和VIM的m RNA较TGF-β诱导组有下降趋势(P=0.011,P=0.002)。Western blot检测结果显示TGF-β诱导组足细胞Podocin的蛋白表达水平(32.923±5.301)较正常对照组(101.807±9.208)明显降低(P0.001),而质粒转染组足细胞Podocin的蛋白表达水平(90.507±7.810)较TGF-β诱导组有升高趋势(P0.001);TGF-β诱导组和质粒转染组足细胞的α-SMA(116.120±8.300和93.832±10.602)、VIM(124.016±9.702和100.801±6.801)的蛋白表达较正常对照组(35.730±4.892和43.801±2.600)明显升高(P0.001),质粒转染组足细胞α-SMA和VIM的蛋白较TGF-β诱导组有下降趋势(P=0.017,P=0.007)。结论:TGF-β1可诱导人足细胞发生转分化,导致其α-SMA、VIM表达增高,Podocin表达减少,BMP-7能显著抑制此现象,提示BMP-7可逆转足细胞EMT,对足细胞损伤具有保护作用。

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