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人心肌肌钙蛋白I的重组表达及其单克隆抗体的制备

杨能  徐霞  
【摘要】:目的构建人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的表达载体,表达cTnI重组蛋白,并制备其单克隆抗体(mAb)。方法以化学方法合成cTnI基因并插入融合表达载体pBV220的多克隆位点,构建重组表达质粒pBV220/cTnI。以重组质粒转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子,经热激诱导目的蛋白的表达,表达产物的免疫学活性用Westernblot进行鉴定。以基因重组的cTnI蛋白为抗原,常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS1细胞融合,获得稳定分泌cTnImAb的杂交瘤细胞株,ELISA检测mAb的相对亲和力;Westernblot检测mAb的特异性。结果酶切鉴定和DNA测序显示cTnI重组表达载体中含有人cTnI全长编码序列。将该重组载体转化入大肠杆菌DH5α中表达所得蛋白经WesternBlot验证为目的蛋白。筛选出2株能稳定分泌特异性抗cTnI的mAb杂交瘤细胞株,免疫球蛋白亚类均为IgG类;Westernblot结果显示,两株单抗识别相对分子量为24000的cTnI单一条带;中和抑制试验表明培养上清中的抗体能明显被cTnI中和;cTnI单克隆抗体的亲和常数为Kaff=1.62×109(mol/L)-1。结论成功地构建了cTnI表达载体、表达出cTnI重组蛋白,制备出抗cTnImAb,为进一步用于cTnI的体外免疫学检测奠定了基础。

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