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miR-214表达载体构建及其对靶基因β-catenin的调控

林述琨  王耀鹏  温吉海  
【摘要】:目的:构建miR-214真核表达载体,验证miR-214对其靶基因β-catenin的调控作用。方法:以基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增包括miR-214前体的基因序列,将其插入表达载体pcDNA3.1(+)获得pcDNA3.1-miR-214真核表达载体。将其转染到A549细胞后,通过实时定量PCR(Real-time PCR)方法对其表达情况进行验证。应用生物信息学预测软件TargetScan、mirBase和PicTar对miR-214靶基因进行预测,并通过双荧光素酶报告基因检测miR-214对靶基因β-catenin的3'UTR区的调控作用。通过Westernblot方法检测miR-214对β-catenin蛋白表达的影响。结果:成功构建miR-214表达载体pCDNA3.1-miR-214。Real-timePCR结果表明pCDNA3.1-miR-214在A549细胞中能够过表达成熟的miR-214基因。生物信息学预测β-catenin是miR-214的靶基因,并构建融合β-catenin的3'UTR区表达质粒pMIR-β-catenin,在此基础上对β-catenin的3'UTR"种子区"进行定点突变。双荧光素酶报告基因分析表明miR-214能够作用于β-catenin的3'UTR。Westernblot方法进一步证实β-catenin是miR-214的靶基因。结论:miR-214作用于β-catenin的3'UTR,可在转录后水平调控β-catenin的表达。

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