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PI3K/Akt信号通路在染尘大鼠肺泡巨噬细胞自噬中作用

王晓艳  宋瑞瑞  张晓雪  沈福海  蒋守芳  李小明  曹燕花  时亚欣  王永斌  金玉兰  
【摘要】:目的观察大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞在染尘处理后的自噬情况,以LY294002阻断磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径,探讨PI3K/蛋白激酶B(Akt)信号通路在其自噬中的调控作用。方法 1常规培养NR8383细胞,分为空白组和染尘处理组,分别采用终浓度为0、50 mg/L的矽尘混悬液处理3、6、12、20和24 h后,收集细胞上清液,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β1(TGF-β1)水平,选择最佳染尘时间。2NR8383细胞分为对照组(予等体积不含血清的F-12K培养基处理)、矽尘组(予终浓度为50 mg/L矽尘混悬液处理)和干预组(予终浓度分别为50 mg/L、20μmol/L的矽尘混悬液和PI3K抑制剂LY294002处理),孵育后收集样品。采用ELISA法检测孵育后20 h时间点细胞上清液中TNF-α和TGF-β1水平;采用蛋白免疫印迹方法测定孵育后20 h时间点细胞中Akt和自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的水平;采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察孵育3、6、12和20 h时间点细胞自噬免疫荧光表达情况,以及加入溶酶体抑制剂磷酸氯喹(CDP)后细胞的自噬表达情况。结果 1离体NR8383细胞染尘模型最佳处理时间为20 h。2矽尘组细胞上清液中TNF-α和TGF-β1水平均高于对照组(P0.05),干预组细胞上清液中TNF-α和TGF-β1水平均高于对照组和矽尘组(P0.05)。干预组细胞中Akt蛋白表达水平分别低于对照组和矽尘组;矽尘组细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平分别高于对照组和干预组(P0.05),干预组和对照组细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白水平比较,差异无统计学意义(P0.05)。LSCM观察结果显示:对照组细胞3和6 h时间点自噬表达分别强于同组12和20 h时间点;矽尘组细胞12 h时间点自噬表达分别强于同组3和6 h,20 h时间点自噬表达稍弱于同组12 h,但仍强于同组3和6 h。与同时间点对照组比较,矽尘组细胞3和6 h时间点的自噬表达略减弱,但12和20 h时间点自噬表达明显增强。干预组细胞各时间点自噬表达均弱于同时间点的矽尘组,尤以20 h时间点明显。加入CDP阻断后,各组细胞的自噬表达均呈不同程度的增强。结论矽尘可诱导NR8383细胞自噬增加,PI3K抑制剂LY294002可下调自噬的表达,推测PI3K/Akt信号通路可能参与矽尘诱导肺泡巨噬细胞的自噬过程。

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