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上调OCT4基因表达对人骨髓间充质干细胞的iPSC相关转录因子表达的影响

郭晓萍  汤永民  
【摘要】:目的:探讨OCT4基因过表达对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow derived mesenchymal stem cells,h BMMSC)i PSC相关转录因子(c MYC、KLF4、LIN28、NANOG、SOX2)表达的影响,为从骨髓造血微环境的角度探索血液系统疾病如白血病、再生障碍性贫血等的发生机制提供实验依据。方法:首先构建重组质粒pcDNA3.1-OCT4表达载体,通过脂质体转染的方式将上述表达质粒导入第3-4代hBMMSC,分别通过PCR及流式细胞术对OCT4 mRNA和OCT4蛋白的过表达进行验证,然后经G418抗性加压下有限稀释和连续亚克隆的方法筛选出稳定表达OCT4的细胞(hBMMSC-OCT4),分别通过RT-PCR和流式细胞术测定iPSC相关转录因子(cMYC、KLF4、LIN28、NANOG、SOX2)mRNA和蛋白的表达,观察OCT4过表达对iPSC相关转录因子表达的影响。结果:成功构建了携带OCT4的重组表达质粒pcDNA3.1-OCT4;通过有限稀释和连续亚克隆的方法筛选出稳定表达OCT4的细胞(hBMMSC-OCT4);流式细胞术检测结果显示,OCT4的平均表达阳性率从未转染时的(3.03±1.49)%增加至稳定表达时的(95.46±1.40)%;RT-PCR证实了OCT4基因的高表达;Real-time PCR结果显示,与未转染的对照组MSC相比,OCT4 mRNA的相对表达量从瞬时转染时的2.75倍增加至稳定转染时的6.23倍,OCT4蛋白的平均表达阳性率从瞬时转染时的(36.36±0.28)%(d 4)升高至稳定转染时的(96.25±1.38)%(d 96)。hBMMSC-OCT4细胞高水平表达干性转录因子(cMYC、KLF4、LIN28、NANOG、SOX2),其平均表达量分别从未转染时的(1.12±0.47)%、(0.84±0.30)%、(2.14±0.79)%、(0.63±0.37)%和(14.34±2.44)%增加至(80.65±4.75)%、(73.03±4.70)%、(68.08±3.05)%、(39.39±1.85)%和(91.45±4.56)%,与RT-PCR结果一致,且NANOG和SOX2的表达水平与OCT4的平均表达量呈正相关(OCT4 vs NANOG:r=0.7802,OCT4vs SOX2:r=0.4981;NANOG vs SOX2:r=0.7426)。结论:获得了稳定表达OCT4的细胞(hBMMSC-OCT4),过表达OCT4可上调hBMMSC干性转录因子(cMYC、KLF4、LIN28、NANOG、SOX2)的表达。

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