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耐药蛋白NDM-1的双抗体夹心ELISA检测方法研究

贾良曦  杨柳  丁亚芳  邢维维  马立才  
【摘要】:旨在建立一种检测细菌中新德里金属β-内酰胺酶(NDM)耐药蛋白双抗体夹心ELISA方法。采用化学合成的方法获得优化后的NDM-1蛋白基因序列,构建表达载体pET-28a-NDM-1(G29-R270),并在大肠杆菌中进行IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot验证重组蛋白。以纯化的NDM-1蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,获得了2株杂交瘤细胞株,分别命名为3H5和4G1,分别作为捕获抗体和检测抗体,通过对包被条件、包被抗体和检测抗体浓度等进行优化,建立双抗体夹心ELISA方法,并对所建立方法的敏感性、特异性等进行了评价。结果表明,经15℃条件下诱导16 h后,SDS-PAGE和Western blot显示目的条带清晰,大小正确。经优化后的双抗体夹心ELISA方法中,捕获抗体和检测抗体的稀释度分别为1∶2 000和1∶5 000,使用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(pH值9.6),4℃过夜包被。该方法对NDM-1阳性大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的最低检出浓度为1×10~5 CFU/mL,NDM-1阳性鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的最低检出浓度为1×10~6 CFU/mL。该方法检测NDM-1、NDM-4、NDM-5和NDM-9,与4种阳性对照菌有明显的交叉,但与大肠杆菌ATCC 25922、大肠杆菌ATCC 35150、鲍曼不动杆菌ATCC 19606、肺炎克雷伯菌ATCC 10031和铜绿假单胞菌ATCC 9027均无交叉反应。板内变异系数小于6%,板间变异系数小于10%,说明本方法具有良好的重复性。综上所述,本研究建立了一种高特异性和高灵敏的双抗体夹心ELISA方法,为耐碳青霉烯类细菌中NDM-1耐药蛋白检测提供了一种技术手段。

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