靶向G蛋白偶联受体91的小发夹RNA慢病毒载体的构建及功能初步检测

【摘要】：目的构建靶向大鼠G蛋白偶联受体91(G protein-coupled receptor 91,GPR91)基因的小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体,探讨GPR91受体对高糖诱导下血管内皮生长因子(vascular endothlial growth factor,VEGF)释放的调节作用。方法设计合成4对针对大鼠GPR91(NM_001001518)的特异性单链寡核苷酸链,两端分别引入Age I和EcoR I酶切位点,退火后得到小片段带黏性末端的双链DNA,克隆入慢病毒载体pGCSIL-GFP,行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA测序鉴定重组体。将各慢病毒shRNA干扰载体和辅助包装载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并行浓缩滴度检测。将各慢病毒载体转染RGC-5细胞后,Western blot法筛选有效的慢病毒shRNA干扰载体。使用45 mmol·L-1的高糖刺激RGC-5细胞24 h,用ELISA法观察干扰GPR91后VEGF的表达情况。结果 PCR及DNA测序结果均显示慢病毒载体pGCSIL-GFP-shGPR91构建正确;包装病毒颗粒后,pGCSIL-GFP-shGPR91-1、2、3、4组病毒浓缩液的滴度依次为1.5×109 TU·mL-1、1.5×109 TU·mL-1、3.0×109 TU·mL-1、3.0×109 TU·mL-1。将慢病毒颗粒感染RGC-5细胞后,Western blot检测显示NC组GPR91蛋白(0.60±0.08)空白组(0.62±0.07)的表达无明显差异(F=49.03,P0.05)。而与空白组相比,4个慢病毒载体组(0.48±0.05、0.34±0.06、0.30±0.04和0.11±0.06)均能不同程度沉默GPR91的表达,差异有统计学意义(F=49.03,P0.01),其中pGCSIL-GFP-shGPR91-3干扰效率最高。ELISA结果显示空白组、高糖组、高糖+NC组、高糖+pGCSIL-GFP-shGPR91-3组VEGF蛋白表达分别为(25.63±4.52)pg·mL-1、(72.74±8.24)pg·mL-1、(71.68±8.31)pg·mL-1和(46.77±6.21)pg·mL-1,表明GPR91病毒干扰载体可显著降低高糖引起的VEGF分泌,差异有统计学意义(F=30.852,P0.01)。结论本实验成功构建了靶向大鼠GPR91的shRNA慢病毒载体并进行病毒颗粒包装。所构建的慢病毒载体能够降低高糖作用下的VEGF表达,为进一步研究GPR91基因在糖尿病视网膜病变中的作用机制和动物基因治疗奠定基础。