γ-谷氨酰激酶基因敲除对产L-精氨酸钝齿棒杆菌8-193生理代谢的影响

【摘要】：【目的】为了阻断L-精氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-精氨酸合成的代谢流,构建钝齿棒杆菌8-193(Corynebacterium crenatum 8-193)γ-谷氨酰激酶(EC:2.7.2.11,γ-glutamyl kinase)基因proB敲除的菌株,并研究proB基因敲除对菌株生理特性的影响。【方法】运用PCR技术分别扩增proB基因的上游和下游序列,构建带有内部缺失的proB基因的敲除载体。经过两次同源重组,敲除C.crenatum 8-193的proB基因,构建菌株8-193-ΔproB,并用带有proB基因的表达载体对8-193-ΔproB进行互补验证。通过摇瓶发酵研究8-193-ΔproB的生理特性。【结果】PCR验证、γ-谷氨酰激酶酶活测定和营养缺陷型鉴定表明,获得了proB基因缺陷的菌株。摇瓶发酵结果表明,与出发菌株相比,8-193-ΔproB生物量降低9.6%,L-精氨酸产量提高13.6%。副产物中谷氨酸族和天冬氨酸族氨基酸含量升高;α-酮戊二酸、磷酸烯醇式丙酮酸和琥珀酸含量降低。proB基因敲除后,菌株的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶活性提高。【结论】对谷氨酸分支代谢途径的阻断可以改善8-193菌株的葡萄糖利用和精氨酸合成能力。