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靶向大鼠Nogo受体基因的小发夹RNA慢病毒载体的构建及病毒包装

刘欣春  朱悦  
【摘要】:目的构建靶向大鼠Nogo受体(NgR)的小发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并进行病毒颗粒包装及滴度测定。方法设计合成3对针对大鼠NgR及1对非特异性的寡核苷酸单链,退火后得到shNgR双链,克隆入慢病毒载体pGC-LV,行聚合酶链反应(PCR)并测序鉴定重组体;构建NgR过表达载体,双酶切并测序鉴定插入序列正确性;NgR过表达载体和各慢病毒shRNA干扰载体共转染293T细胞后,定量反转录(RT)-PCR及蛋白印迹法筛选有效的慢病毒shRNA干扰载体;重组NgR慢病毒shRNA干扰载体和病毒包装质粒共转染293T细胞,包装并收集病毒颗粒,进行病毒浓缩液滴度检测。结果 PCR及DNA测序结果均显示慢病毒载体pGC-LV-shNgR构建正确;双酶切及测序亦显示NgR过表达载体插入序列正确;定量RT-PCR及蛋白印迹法结果表明所构建的3个慢病毒载体pGC-LV-shNgR均可以有效干扰NgR的表达,其中pGC-LV-shNgR-A干扰效率最高;包装病毒颗粒后,检测病毒浓缩液的滴度为2×107 TU/mL。结论成功构建靶向大鼠Nogo受体的shRNA慢病毒载体并进行病毒颗粒包装,浓缩的病毒液可以用于后续研究。

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