bta-miR-377琼脂糖凝胶电泳条件优化

【摘要】：bta-miR-377与下丘脑分泌的可卡因苯丙胺调节转录肽（Cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART）存在靶向结合关系。为分析bta-miR-377在牛下丘脑组织中的表达情况，为后续探讨bta-miR-377与CART相互作用进而影响牛卵泡发育的作用机制奠定基础，经Trizol法提取牛下丘脑总RNA，采用茎环结构法设计特异性引物，并利用半定量RT-PCR技术克隆bta-miR-377，观察不同条件琼脂糖凝胶电泳后Marker和目的条带的分离情况，其中凝胶浓度为2.0%、2.5%；电压为100、80 V；时间为40、60、80 min；同时通过Image J软件对不同条件下获得的bta-miR-377条带进行灰度值分析，结合电泳结果确定最佳分离条件。结果显示，利用茎环结构法能够达到延长bta-miR-377片段的目的，且特异性强；凝胶浓度为2.5%、电压为80 V、时间为80 min时，bta-miR-377条带分离效果好且表达量高，该条件下条带的灰度值与其他组相比差异显著，与电泳分析结果一致，说明低浓度凝胶的分辨率低，长时间高压会导致DNA降解进而使条带弥散，而适当电压下电泳时间过短会使DNA分子无法聚集而使条带过宽，说明适宜的电泳条件是鉴定目的 miRNA表达的关键。综上可见，bta-miR-377在牛下丘脑中有表达，丰富了动物生殖生理学中下丘脑-垂体-性腺轴的内分泌调控理论。