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重组人VEGF_(121KDR)/rGEL融合毒素在大肠埃希菌中的表达、纯化及其活性

孙红琰  刘爱军  申云飞  李月  刘敏霞  武福军  申严杰  周满祥  
【摘要】:目的在大肠埃希菌中表达具有血管内皮生长因子受体2(vascular endothelialgrowthfactorreceptor2,VEGFR2)/KDR(含激酶插入域的受体)特异性的重组人VEGF121KDR/白树籽核糖体失活蛋白(rGEL)融合毒素,纯化后检测其生物活性。方法将rhVEGF121KDR/rGEL融合毒素全基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-VEGF121KDR/rGEL,转化大肠埃希菌Origami(DE3),IPTG诱导表达;表达的目的蛋白经SP-Sepharose FF、Ni-Sepharose FF纯化后,用凝血酶酶切,酶切产物经Q-Sepharose FF纯化;以细胞表面分别高表达VEGFR1/FLT1和VEGFR2/KDR的猪动脉血管内皮细胞PAE/FLT1和PAE/KDR为靶细胞,检测纯化的rhVEGF121KDR/rGEL融合毒素的细胞毒性。结果重组原核表达质粒pET-32a(+)-VEGF121KDR/rGEL经双酶切和测序证实构建正确;表达的目的蛋白为标签蛋白硫氧化还原蛋白(thioredoxin,Trx)与rhVEGF121KDR/rGEL的融合蛋白,其相对分子质量约为62 000,蛋白呈可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的20%,去除标签蛋白的纯化rhVEGF121KDR/rGEL融合毒素相对分子质量约为43 000,纯度大于98%;VEGFR2阳性细胞PAE/KDR和VEGFR1阳性细胞PAE/FLT的半数抑制浓度(IC50)分别为0.32和278 nmol/L,后者为前者的800多倍。结论已成功在大肠埃希菌中表达了rhVEGF121KDR/rGEL融合毒素,纯化的融合毒素对过度表达VEGFR2的血管内皮细胞具有很强的杀伤作用,为进一步研究其抗肿瘤作用及开发新型靶向抗癌药物奠定了基础。

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