收藏本站
收藏 | 投稿 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

hTERT重组第三代慢病毒载体的构建及其病毒包装鉴定

钟艳平  林若芸  黎丹戎  胡晓霞  王琪  李力  
【摘要】:目的:构建携带人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的慢病毒表达载体及探索高滴度第三代慢病毒包装体系的建立,并观察hTERT基因在细胞中的表达调控。方法:将hTERT基因片段插入慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒表达质粒pCDH-hTERT。通过酶切、DNA测序验证hTERT片段的准确性后,将pCDH-hTERT、pCDH-PACK-GAG、pCDH-PACK-REV和VSV-G共转染包装细胞293T,浓缩上清并测定病毒滴度获得重组慢病毒,并通过PCR及293T中hTERT蛋白的表达鉴定重组慢病毒。将重组慢病毒感染靶细胞,通过检测标记蛋白-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、hTERT蛋白表达和端粒酶活性进一步验证pCDH-hTERT在细胞中表达。结果:pCDH-hTERT携带正确hTERT基因,将其与包装质粒共转染293T细胞能产生重组病毒;病毒基因组PCR证实hTERT基因插入,感染293T后可检测到hTERT蛋白的表达;目的基因hTERT能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞并稳定表达,荧光显微镜下可直接观察GFP;RT-PCR、Western blot及TRAP-PCR-ELISA法检测感染后的细胞,发现hTERTmRNA、hTERT蛋白的表达及端粒酶活性明显增强。结论:成功构建了第三代慢病毒表达载体pCDH-hTERT,并获得高效的重组慢病毒,能将外源hTERT基因导入靶细胞重建端粒酶活性,为构建永生化细胞系奠定基础。

知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 范霖;马志昭;高山峨;路建伟;李思光;潘晓静;;用Fugene6制作高滴度慢病毒方法的优化比较[J];中国细胞生物学学报;2011年04期
2 张帆;方彧聃;张敬之;;以HIV-1为骨架的慢病毒载体在其假病毒的转录本中保留其内含子不被剪切[J];生命科学研究;2011年03期
3 崔勇;陈静;王君玉;王麒;胡国汉;骆纯;卢亦成;;AKT2基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定[J];现代生物医学进展;2011年08期
4 陈平;胡涛;薛敬礼;杜春燕;章金涛;朱奎成;金树兴;王纯耀;;利用慢病毒载体快速建立表达外源基因的哺乳动物细胞系[J];生物技术通报;2011年07期
5 陈斌;李建彬;米志强;安小平;李存;刘大斌;姜焕焕;王娟;黄芬;张宝中;范华昊;何后军;童贻刚;;利用移码突变和终止密码子提高下游目的基因的表达水平[J];中国生物工程杂志;2011年08期
6 戴建威;章倩倩;刘松财;张明军;张永亮;;慢病毒载体介导GHRH基因在小鼠肌肉组织表达及对动物生长的影响[J];中国生物工程杂志;2011年07期
7 卢晓芳;杜晶春;李磊;赖文玉;张秀明;李伟强;杨霞;项鹏;;新型慢病毒载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞基因转导中的应用[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年23期
8 杨鹏翔;王曦晨;王宇祥;王启贵;李辉;;转基因鸡生物反应器载体的构建及其表达特性分析[J];生物工程学报;2011年08期
9 ;Nature Biotechnology导读[J];生物技术进展;2011年02期
10 孙强明;潘玥;赵玉娇;陈俊英;施海晶;马绍辉;;人Semaphorin 4D慢病毒载体的构建及鉴定[J];中国生物工程杂志;2011年07期
11 陈豪;李丹;林纳;黄月红;陈志新;王小众;;乙肝病毒X基因慢病毒载体的构建和鉴定[J];福建医科大学学报;2011年03期
12 石晓月;贺敏;任鹏;宋丽雅;乔志新;杨晓琮;程宏;冯秋月;张公庆;王璇琳;宫宁;王字玲;李伟静;于群;;慢病毒介导的稳定表达人GM-CSF、IL-4的EA.hy926细胞株的建立[J];生物技术通讯;2011年04期
13 徐远玲;张旭东;马宏宝;;腺病毒载体左侧反向末端重复区对下游基因表达特异性的影响[J];郑州大学学报(医学版);2011年04期
14 李秀梅;尤玉琴;刘光泽;黎经纬;陈媚娟;陈文吟;周军辉;孔祥平;;慢病毒介导的绿色荧光蛋白转基因小鼠的制备及鉴定[J];解放军医学杂志;2011年09期
15 ;[J];;年期
16 ;[J];;年期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王海彬;;雌激素相关受体α基因超表达慢病毒载体的构建[A];中华医学会第六次全国骨质疏松和骨矿盐疾病学术会议暨中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会成立十周年论文汇编[C];2011年
2 高书颖;于洁;;携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年
3 刘竞;余锋;桂嵘;李昕;蒋铁斌;王二华;李颖;王成红;唐雪元;陈方平;;Survivin shRNA慢病毒载体构建[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
4 宋达疆;黄晓元;任利成;杨兴华;肖目张;王双;;TREM-1基因RNAi慢病毒载体的构建及功能初步检测[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
5 曾东风;陈幸华;孔佩艳;徐葳;张曦;;PINCH-1基因RNAi慢病毒载体的构建及鉴定[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
6 彭代智;王丽华;刘敬;周新;王勇;何升东;何斌;郑必祥;董征学;周光前;;CCL20基因敲低型组织工程皮肤种子细胞的克隆筛选及其干扰效果[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
7 ;技术方法[A];中国解剖学会2010年年会论文文摘汇编[C];2010年
8 苏玉虹;张俊峰;;在哺乳动物细胞内诱导持续性的RNAi研究策略[A];中国畜牧兽医学会养猪学分会第五次全国会员代表大会暨养猪业创新发展论坛论文集[C];2010年
9 欧阳红生;逄大欣;;遗传修饰猪制备及其在生物医学中的应用[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年
10 潘传英;蓝贤勇;陈宏;Colin E Bishop;;利用特定因子诱导293T细胞的重编程研究[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郝林琳;慢病毒介导的生长抑素siRNA对小鼠生长轴激素的影响[D];吉林大学;2009年
2 钱建平;携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体转染几种皮肤结构重要细胞的实验研究[D];中国协和医科大学;2008年
3 徐世永;慢病毒载体法高效转基因鸡制备技术研究[D];南京农业大学;2007年
4 刘美玲;睾丸特异表达基因LM23的性质和功能研究[D];中国协和医科大学;2010年
5 朱贵明;ω-3脂肪酸去饱和酶基因的克隆、鉴定及转基因小鼠的制备[D];西北农林科技大学;2006年
6 包杰;RNA干扰RelB慢病毒载体的构建及其诱导骨髓致耐受树突状细胞的实验研究[D];南方医科大学;2007年
7 戴建威;生长激素双向调节病毒载体系统在小鼠肌肉组织的表达及对生长的影响[D];吉林大学;2008年
8 张锐;稳定表达靶向HSV2 VP16 shRNA重组细胞系的建立及其对HSV2复制能力影响研究[D];郑州大学;2012年
9 蒋佳;双基因修饰组织工程骨的构建及其成骨的研究[D];上海交通大学;2008年
10 张文卿;HCMV pp150表达及E1-pp65慢病毒载体刺激T细胞免疫应答的研究[D];山东大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 魏衍全;慢病毒介导shRNA稳定持续抑制口蹄疫病毒增殖的两类细胞系的建立[D];中国农业科学院;2011年
2 张国峰;慢病毒载体介导的RNAi抑制牛整联蛋白亚基αv基因表达的研究[D];中国农业科学院;2011年
3 王栋;编码t-PA基因慢病毒载体的构建及其制备体系的建立[D];山东师范大学;2009年
4 杨馨;NR2B慢病毒载体构建和病毒生产[D];华东师范大学;2006年
5 王星星;重组hTERT启动子启动CD基因慢病毒载体构建及电穿孔法包装慢病毒颗粒[D];重庆大学;2009年
6 王超;双启动子驱动的LfcinB基因慢病毒载体的构建及体外对SKOV3细胞作用的研究[D];安徽医科大学;2009年
7 苏一鸣;构建过表达神经生长因子β亚基基因的慢病毒载体的实验研究[D];福建医科大学;2010年
8 于淼;小鼠DND1慢病毒载体的构建及病毒生产[D];湖南师范大学;2010年
9 李朋;PR1-HLA-A*0201单链三聚体慢病毒载体的构建及初步研究[D];扬州大学;2011年
10 李玉恒;CIRP过表达和干扰慢病毒载体的构建与分析[D];黑龙江八一农垦大学;2012年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 记者 王菲 胡江;新疆科学家“破解”绵羊转基因技术“密码”[N];新疆科技报(汉);2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978