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烟草NtMYB4a基因CRISPR/Cas9敲除载体构建与遗传转化

蒋悦  罗倩  杨琴  李红强  谢瑞莹  聂琼  
【摘要】:MYB转录因子在植物生长发育和抵御胁迫中起着重要的作用。为开展烟草(Nicotiana tabacum) NtMYB4a的功能研究和新种质的创制,本研究以NtMYB4a为靶基因,根据其CDS序列在第1和第3外显子上选定两个靶标Y1和B1,分别合成Oligo二聚体后和CRISPR载体连接,转化大肠杆菌(Escherichia coil)感受态DH5α后提取质粒并测序,将测序正确的质粒Y1-1和B1-1经LguⅠ酶切后用T_4连接酶进行重组连接,成功构建了CRISPR/Cas9编辑系统的双靶标敲除载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法来转化烟草,经PCR和测序鉴定获得29株阳性植株,阳性率为24.37%,其中15株在靶点和非靶点处发生了不同程度的突变,共有4种突变类型,突变率为51.72%。初步观察发现NtMYB4a编辑T_0代植株出现不同程度的矮化和花色变异,甚至死亡。qRT-PCR分析发现T_0代植株花、茎、叶中NtMYB4a表达量不同程度下调。本研究为后续开展NtMYB4a的功能和以NtMYB4a为节点的分子调控机制研究提供了基础资料。

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