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CRISPR/Cas9介导的外源基因在猪PSP位点的定点整合

靳伟  代敏敏  李德娟  樊宝良  
【摘要】:唾液腺生物反应器作为一种新型生物反应器,是利用唾液分泌蛋白的调控区特异性表达各种外源蛋白,常用的唾液分泌蛋白为腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein, PSP)。本研究旨在建立利用CRISPR/Cas9系统对猪(Sus scrofa) PSP基因定点整合的方法体系,并分析CRISPR/Cas9对PSP基因整合的脱靶效应,筛选获得能够实现上述目标的有效的基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA。实验首先根据PSP基因序列在线设计单链引导RNA (single guiding RNA, sgRNA),选出5条sgRNA序列;然后利用sgRNA体外转录试剂盒和Cas9体外酶切试剂盒,筛选出靶向PSP基因体外酶切活性较高的sg RNA序列,构建sgRNA和Cas9共表达载体pCas9-sgRNA,同时构建携带新霉素抗性基因(neomycin resistance gene, NeoR)表达结构的打靶载体pMD19-5'arm-NeoR-3'arm;最后将sgRNA和Cas9共表达载体和打靶载体共转染猪肾细胞(PK-15细胞),利用新霉素进行筛选,分离单细胞克隆。通过PCR及测序鉴定NeoR定点敲入阳性单克隆细胞并进行脱靶效应分析。体外酶切结果表明,sgRNA1、sgRNA3、sgRNA4和sgRNA5均有较高的体外酶切活性;测序结果显示,4个sgRNA均成功针对猪PSP基因实现了定点敲入,sg RNA1、sgRNA5敲入效率分别为22.7%(5/22)和26.1%(6/23),且均存在1个潜在脱靶位点发生了脱靶效应;sgRNA3、sgRNA4敲入效率分别为50.0%(12/24)和42.1%(8/19),5个潜在脱靶位点均未发生脱靶效应。本研究成功建立了针对猪PSP基因进行基因编辑的方法体系,筛选出高效引导外源基因定点敲入猪PSP基因的sgRNA,为深入研究转基因猪提供了基础资料。

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