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Keratin 5-IRES-eGFP敲入的人胚胎干细胞系的构建

郑雯  钟亚丹  王炫  刘慧婷  杨斌  刘军  
【摘要】:目的 利用CRISPR/Cas9技术构建一种keratin 5-IRES-eGFP敲入的人胚胎干细胞(hESCs)系,为研究表皮基底角质形成细胞异常的皮肤病提供一种细胞模型。方法 构建针对目的基因keratin 5的sgRNA质粒及打靶Donor质粒,利用CRISPR/Cas9技术完成对keratin 5的定向切割,将IRES-eGFP敲入至keratin 5终止密码子上游,诱导hESCs分化为表达绿色荧光蛋白(GFP)的基底层角质形成细胞。结果 PCR及Sanger测序结果表明IRES-eGFP成功整合至hESCs细胞系的keratin 5终止密码子上游,分化培养后观察细胞形态与角质形成细胞系HaCat形态一致。免疫荧光染色验证hESCs分化获得的ES-KC细胞系稳定表达GFP与keratin 5。结论 成功制备了keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs细胞系,并诱导hESCs成功分化出带有绿色荧光蛋白标记的基底层角质形成细胞。

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