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中华按蚊电转化显微注射技术平台的构建及其在基因瞬时过表达中的应用

车林茸  何正波  韩宝珠  陈晓洁  闫振天  乔梁  陈斌  
【摘要】:【目的】构建在中华按蚊Anopheles sinensis中的电转化显微注射技术平台,并利用该技术平台实现活体基因瞬时过表达对其进行验证,为开展系统的基因功能研究奠定基础。【方法】以CUY21EDITⅡ电转仪为主体构建中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;使用同源重组法构建EGFP和Bm-iAANAT基因的瞬时过表达质粒,在中华按蚊化蛹3 h时注射该质粒进入蛹体,随即使用电转仪对注射后的蛹进行电击,待注射个体发育至化蛹39 h时,利用体视荧光显微镜观察蛹体表皮着色和发光情况,并通过荧光定量PCR检测EGFP和Bm-iAANAT的表达。【结果】构建了用于显微注射的PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV40和PIZ-modi-Aepub-AANAT-T2A-EGFP-SV40过表达载体。PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV40注射组中华按蚊在化蛹39 h时约87.5%的个体成活并正常黑化,这其中约92.7%的个体的表皮检测到明显的绿色荧光,注射无启动子载体PIZ-modi-EGFP-SV40并进行电击的阴性对照组和注射过表达载体PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV40但未进行电击的阳性对照组个体则没有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,注射组中发光个体的EGFP基因明显高表达。PIZ-modi-Aepub-AANAT-T2A-EGFP-SV40注射组的蛹在化蛹39 h时有80.4%个体存活,这其中92.2%的个体相对于注射无启动子载体PIZ-modi-AANAT-T2A-EGFP-SV40的阴性对照组和注射过表达载体PIZ-modi-Aepub-AANAT-T2A-EGFP-SV40但未进行电击的阳性对照组个体黑化明显受阻,且有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,报告基因Bm-iAANAT和EGFP的表达明显提高。【结论】成功构建了在中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现报告基因在活蛹中的瞬时过表达,并产生了目的表型。这为中华按蚊功能基因组研究奠定了基础。

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