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基因重组毕赤酵母表达瑞替普酶过程中的酶活性分析

邹敏  储炬  
【摘要】:目的研究毕赤酵母诱导表达瑞替普酶过程中的关键酶活性。方法以摇瓶培养为研究对象,在用甲醇诱导后,连续取样,破碎菌体制成无细胞悬液,检测乙醇氧化酶、甲醛脱氢酶、PDC、G-6-PD、ID、α-KGD和SD的活性。结果乙醇氧化酶比活在0~6 h逐渐增加,在第6 h达到最大44.5 U/mg蛋白,随后迅速下降,在第24~48 h有所回升,然后又逐渐降低。FAD比活在第0~48 h逐渐增加,在第48 h达到最大值6.72 U/mg蛋白,随后逐渐降低,直至放瓶。G-6-PD比活在第2 h~6 h逐渐增加,在第6~24 h逐渐降低,在第24~48 h逐渐升高,48 h后又逐渐降低直至放瓶。PDC比活在第0~6 h逐渐降低,随后略有升高的趋势。ID、α-KGD、SD的活性变化有相似趋势。在前6 h酶活均迅速下降,在第6~24 h缓慢下降,随后ID活性继续缓慢下降,而α-KGD和SD活性在第24~48 h逐渐升高,在第48 h均达到最高值,然后又逐渐降低,直至放瓶。结论根据酶活变化规律,可将整个诱导期分为4个阶段:第Ⅰ阶段为诱导0~6 h,是甲醇适应期;第Ⅱ阶段为诱导6~24h,是快速生长期;第Ⅲ阶段为诱导24~48h,是产物积累期;第Ⅳ阶段为诱导48~72h,是代谢缓慢期。在甲醇适应期,甲醇完全氧化代谢流占主导地位。在快速生长期和产物积累期,代谢流逐渐向糖酵解途径和TCA循环途径迁移。

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