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KDR siRNA表达载体的构建和鉴定

缪应业  刘家云  易静  苏明权  沈建军  郝晓柯  
【摘要】:目的构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(VEGFR2),又称激酶功能区受体(KDR)的pSilencerTM3.1siRNA(smallinterferingRNA)表达载体,并在前列腺癌细胞PC3中观察其干扰效果.方法设计针对KDR基因编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经BamHⅠ,HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencerTM3.1-H1neo中,对重组质粒进行酶切分析和DNA系列测定.以脂质体法将pSilencerTM3.1-H1neo空载体和3个(pSilencer3.1-KDR1,pSilencer3.1-KDR2和pSilencer3.1-KDR3)重组质粒分别导人PC3前列腺癌细胞系.72h后用RT-PCR和Westernblotting技术检测各实验组前列腺癌细胞内KDRmRNA及蛋白水平的表达情况.结果经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的基因片断.转染KDR-siRNA的前列腺癌细胞,72h后,而以pSilencer3.1-KDR3的抑制KDRmRNA及蛋白表达效果最为有效,其抑制率约为55%.结论成功构建了针对KDR的RNA干扰表达载体pSilencer3.1-KDR1,pSilencer3.1-KDR2和pSilencer3.1-KDR3,pSilencer3.1-KDR3能有效抑制KDR在前列腺癌细胞中表达,为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.

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