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人颗粒溶素活性肽和小鼠白细胞介素-12基因真核穿梭共表达质粒的构建与真核表达

张黎  王瑜伟  何永林  帖儒修  
【摘要】:目的构建含分枝杆菌复制子Orim,可分泌表达人颗粒溶素相对分子质量为9000的活性肽与小鼠白细胞介素-12(mIL-12)的真核穿梭共表达质粒,并检测其蛋白表达。方法以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得相对分子质量为9000的颗粒溶素活性肽基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,经双酶切及插入片段测序对质粒进行鉴定。同时,将mIL-12亚克隆入pBudCE4.1另一多克隆位点,构建真核共表达质粒pBudCE41-S9K/mlL-12。然后,将分支杆菌复制子Orim亚克隆入真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mlL-12,形成穿梭共表达质粒。采用RT-PCR、免疫细胞化学法,检测颗粒溶素活性肽在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌。ELISA检测mIL-12的表达。结果酶切、PCR及测序鉴定证实,颗粒溶素活性肽基因插入片段正确;RT-PCR和免疫细胞化学检测表明其可以在细胞中瞬时表达;ELISA检测细胞培养上清有mIL-12表达。结论成功构建穿梭共表达质粒pBM9,并能体外表达。

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