家蚕孵化酶样基因BmHEL的原核表达及蛋白纯化与功能鉴定
【摘要】：孵化酶(hatchingenzyme,HE)是后生动物卵孵化过程中起关键作用的一类蛋白酶。在已完成全长967bp的家蚕孵化酶样基因(BmHEL)克隆及其转录特性分析的基础上,研究了该基因在原核表达系统的表达、产物纯化及其对家蚕卵壳的降解功能。以全长BmHEL质粒DNA为模板,用PCR方法分别获得了该基因的开放阅读框(BmHELORF,885bp)、缺失信号肽编码区(BmHELa,834bp)和推测成熟酶功能编码区(BmHELb,624bp)的3个片段,并亚克隆入原核表达载体pET28a(+),在大肠杆菌(E.coli)BL21中进行表达。表达的3种外源蛋白均以包涵体形式存在,获得含有6×His-Tag标签的融合蛋白,其分子质量分别为33.4、31.8、24.0kD。通过Westernblot方法检测到了用Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白。纯化复性后的3种孵化酶对家蚕卵壳底物有一定降解活性,其中BmHELORF的活性最高,BmHELb的活性最低。在pH7.1反应条件下3种酶的活性比pH9.5时高。研究结果在蛋白质水平上进一步证实家蚕孵化酶样蛋白参与了蚕卵孵化这一重要生命过程。
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