收藏本站
收藏 | 投稿 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

灰飞虱原肌球蛋白的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

徐秋芳  陈晴晴  倪海平  李硕  张金凤  周益军  
【摘要】:【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白(tropomyosin,Tm)能与水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因(Tm),将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框(open reading frame,ORF)。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序分析,利用DNAstar软件分析该基因序列及其编码的蛋白特性。将测序验证正确的Tm通过EcoR V和BamH I限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pET-32a(+)。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经终浓度为0.4mmol·L-1的IPTG诱导表达4 h后检测Tm融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用Ni-NTA Agarose纯化上清中的可溶性融合蛋白,经100 mmol·L-1咪唑洗脱和0.01 mol·L-1 PBST溶液透析后获取纯化的Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备多克隆抗血清,并采用间接ELISA法检测抗血清效价。纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的Tm多克隆抗体进行Western blotting检测,分析抗体的特异性。【结果】序列分析显示,灰飞虱Tm的ORF大小为852 bp。采用RT-PCR克隆获得此ORF并进行测序分析,结果表明扩增所得灰飞虱Tm的ORF长为852 bp,编码283个氨基酸,理论分子量大小为32.6 kD。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守。将Tm ORF克隆入pET-32a(+)表达载体后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。纯化上清中的可溶性Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备了多克隆抗体。抗体效价测定结果显示该抗体具有较好的灵敏度,效价大于1﹕409 600。采用制备的Tm多克隆抗体检测纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白,分别检测到一条约55 kD和约37 kD的特异性条带,表明该抗体有较强的特异性。【结论】克隆获得了灰飞虱Tm的ORF,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了诱导表达,纯化获得了Tm融合蛋白,制备了高效价的Tm多克隆抗体。

知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 龚祖埙,曹天钦;对虾原肌球蛋白晶体和纤维的电子显微鏡观察[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;1964年04期
2 吴尚懃,吴厚余,施奠族;文昌鱼原肌球蛋白在胚胎分化过程中出现的时间和位置[J];海洋与湖沼;1982年03期
3 郭桂云;郭春生;刘国平;李玉滨;;大麻哈魚(Oncorhynchus Keta)原肌球蛋白的提取结晶及电鏡观察[J];哈尔滨师范大学自然科学学报;1988年03期
4 潘家秀,曹蕙婷,王桂元,曹天钦;肌肉蛋白的免疫化学研究——Ⅰ.软骨鱼系原肌球蛋白的免疫化学特性与其结构的关系[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;1964年01期
5 杨静娴;原肌球蛋白的分子生物学研究进展[J];大连医科大学学报;2004年02期
6 陈明,韩永根,李爱媛,范世藩;螯虾腹屈肌肌原纤维副肌球蛋白和原肌球蛋白的分离和结晶[J];动物学报;1985年03期
7 戴建凉,方国洪,唐榕,曾立,徐坚,顾少华,谢毅,毛裕民;人原肌球蛋白结合蛋白3(TMOD3)cDNA的克隆及功能初步分析[J];复旦学报(自然科学版);2000年06期
8 任东涛,刘爱校,阎隆飞;萌发百合花粉中原肌球蛋白的免疫鉴定及免疫荧光定位[J];自然科学进展;1999年04期
9 解兵;;兔心肌和骨骼肌的原肌球蛋白的α-链的同质性[J];医学分子生物学杂志;1980年02期
10 D.D.Thomas;J.C.Seidel;J.Gerhely;王沪祥;;分子运动和肌肉收缩的机制及其调节[J];滨州医学院学报;1984年02期
11 曹建平,刘述先;日本血吸虫原肌球蛋白编码基因克隆和表达[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;2001年01期
12 郭春生,徐娉婷,姚恒标,徐海成;鲟鱼原肌球蛋白的提取、结晶与电镜观察[J];哈尔滨师范大学自然科学学报;1990年03期
13 潘家秀,曹蕙婷,徐俊杰,任梅轩;肌肉蛋白的免疫化学研究——Ⅱ.软骨鱼系原肌球蛋白免疫化学的若干有关数据[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;1964年01期
14 郭春生;刘国平;殷建文;邹永水;刘家清;;文昌魚与七鳃鳗等动物原肌球蛋白的氨基酸组成与进化[J];哈尔滨师范大学自然科学学报;1988年03期
15 李玉滨;郭桂云;郭春生;刘国平;;三种黑龙江特产鱼原肌球蛋白分子量的测定和比较[J];哈尔滨师范大学自然科学学报;1988年04期
16 叶丽虹,秦宵然,张晓东,齐众,钱令嘉,侯志波,王洪辉,徐少峰;原肌球蛋白、波形纤维蛋白和热休克蛋白70在肝癌转移亚细胞中表达上调[J];中国生物化学与分子生物学报;2005年02期
17 张友尚,曹天钦;兎原肌球蛋白在不同溶剂中的构型变化[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;1962年02期
18 曹天钦,龚祖埙,邹永水,张友尚,彭加木;原肌球蛋白和副肌球蛋白晶体的电子显微镜观察[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;1963年02期
19 焦明大,曾宪录,王晓光,郝水;多头绒泡菌核仁及其骨架中原肌球蛋白的免疫细胞化学鉴定[J];微生物学报;1999年05期
20 刘光明;梁银龙;翁凌;苏文金;黄园园;曹敏杰;;锯缘青蟹主要过敏原的纯化与鉴定[J];水生生物学报;2010年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 龔祖埙;彭加木;曹天欽;;原肌球蛋白纤維的电子显微鏡观察[A];中国生理科学会学术会议论文摘要汇编(生物化学)[C];1964年
2 彭加木;龔祖塤;熊立民;曹天欽;;原肌球蛋白及副肌球蛋白分子的直接观察[A];中国生理科学会学术会议论文摘要汇编(生物化学)[C];1964年
3 阮韦伟;曹敏杰;蔡秋凤;苏文金;王有朝;陈亨莉;刘光明;;糖链对拟穴青蟹原肌球蛋白致敏性的影响[A];渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
4 潘家秀;熊立民;曹蕙婷;徐琴鈺;曹天欽;;副肌球蛋白是不是一种原肌球蛋白?[A];中国生理科学会学术会议论文摘要汇编(生物化学)[C];1964年
5 叶红萍;王华黎;盛沛根;邹永水;;猪心原肌球蛋白的自旋标记研究[A];第四届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];1986年
6 张燕;高顺强;森田荣伸;;蚬汤致过敏二例[A];中华医学会2009年全国变态反应学术会议论文汇编[C];2009年
7 张润慧;曲伍;郑万鹏;古小彬;王淑贤;杨光友;;疥螨原肌球蛋白基因的克隆表达、蛋白定位与免疫保护试验[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
8 刘志刚;邬玉兰;杨睿;吴海强;;家蚕变应原tropomyosin基因的克隆表达、纯化[A];中华医学会2009年全国变态反应学术会议论文汇编[C];2009年
9 曾仲奎;李健凡;高朝龙;;在不同处理条件下兔原肌球蛋白分子的稳定性与其末端結构[A];中国生理科学会学术会议论文摘要汇编(生物化学)[C];1964年
10 马兵;吴军;易绍萱;贺伟峰;孙榆;;原肌球蛋白在增生性瘢痕中的表达与作用研究[A];全国危重烧伤患者早期复苏对策专题研讨会论文汇编[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 徐升胜;家蚕和野桑蚕粗肌丝结构基因的研究[D];苏州大学;2009年
2 齐义军;河南食管癌高发区食管鳞癌及癌旁组织比较蛋白质组研究[D];郑州大学;2006年
3 赵秀丽;不同肢端畸形中HOXD13、TNNI2和TPM2基因的突变鉴定[D];中国协和医科大学;2006年
4 冯娟;扩张型心肌病转基因小鼠模型的建立和心肌病修饰基因的筛选[D];中国协和医科大学;2008年
5 朱红;HaCaT细胞系与皮肤鳞癌细胞系SCL-1蛋白质组差异分析的研究[D];中国医科大学;2006年
6 夏艳勋;日本血吸虫性别差异表达基因的筛选及新基因的克隆分析[D];华南农业大学;2006年
7 余秋波;早期自然流产蜕膜组织基因表达谱和蛋白质组研究[D];重庆医科大学;2007年
8 孙劲旅;户尘螨过敏原实验研究[D];中国协和医科大学;2002年
9 孙明莉;应用蛋白质组学技术筛选急性早幼粒细胞白血病维甲酸耐药相关蛋白及其机制的探讨[D];吉林大学;2007年
10 魏秀岩;油酰胺对孤养模型小鼠行为学改变的影响及机制探讨[D];沈阳药科大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 乌云娜;超高压处理对牛骨骼肌原肌球蛋白结构的影响[D];内蒙古农业大学;2011年
2 杨梅;人类原肌球蛋白亚型5在溃疡性结肠炎中的表达及临床意义[D];山西医科大学;2014年
3 徐丹;原肌球蛋白对血管平滑肌细胞游走能力影响的研究[D];大连医科大学;2003年
4 孔祥臣;原肌球蛋白对肌球蛋白的作用研究[D];大连医科大学;2008年
5 吉色曲伍;疥螨原肌球蛋白基因的克隆、表达与蛋白定位研究[D];四川农业大学;2011年
6 邢继兰;土耳其斯坦东毕吸虫cDNA文库的构建及原肌球蛋白基因的克隆和表达[D];中国农业科学院;2004年
7 李婵;梭子蟹过敏原分析及原肌球蛋白关键抗原表位重组表达[D];天津医科大学;2013年
8 张景芝;旋毛虫与SP2/0骨髓瘤细胞间相关抗原的研究[D];吉林大学;2007年
9 梁银龙;蟹类过敏原的研究[D];集美大学;2008年
10 黄园园;水产过敏原的模拟胃肠液消化[D];集美大学;2009年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978