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《遗传》 2010年09期
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下一代测序cDNA样品制备及优化技术探讨

秦巧平  张岚岚  李南羿  崔永一  徐凯  
【摘要】:下一代测序技术目前已经应用于微生物、人类、动物、植物等的基因组分析。样品制备是开展大规模测序的必要前提和测序成功的根本保证。对大规模测序造成干扰的主要因素有:polyA干扰测序信号及高丰度基因对低丰度基因的掩盖等。文章以堇菜(Viola verecumda A.Gray)叶片为试材,提取总RNA,合成双链cDNA,利用DSN核酸酶对双链cDNA进行均一化处理,并对双链cDNA polyA进行了切除,将处理后的cDNA进行了TA克隆,挑取100个克隆随机测序。结果表明,未处理的cDNA样本测序有15个克隆由于polyA的存在而影响了附近碱基的正确阅读,独立克隆只有62个,而处理后的cDNA样本经测序未发现polyA,独立克隆有94个。序列分析发现,经过处理的cDNA样本随机测序有两个克隆是经MALDI-TOF检测在样本中有蛋白质峰,而基因克隆一直没有分离到的序列。以处理后的cDNA样本为模板扩增2个已知表达丰度差异较大的基因显示,处理后这2个基因的PCR扩增产量差异明显减小。这些结果表明polyA切除、DSN核酸酶处理的cDNA样本完全满足大规模测序、寻找新基因的要求。

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