葡萄糖激酶基因真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达
【摘要】：目的构建葡萄糖激酶(GK)基因真核表达载体并于COS-7细胞内表达,为体外构建具有葡萄糖刺激性胰岛素分泌能力的基因工程细胞奠定基础。方法质粒pCMV4-GKZ1以EcoRI、BamHI双酶切,获得GK cDNA,与同样酶切的pcDNA3.1载体连接,建成重组载体pcDNA3.1-GKZ1,经酶切与测序鉴定。Lipofectamine2000介导pcDNA3.1-GKZ1转COS-7细胞,分别以RT-PCR及Western-blot对COS-7/GKZ1细胞中GKZ1基因的转录及表达进行检测。结果构建的pcDNA3.1-GKZ1重组载体经酶切有1450 bp的GKZ1 cDNA,序列经测序证实。COS-7/GKZ1细胞RT-PCR扩增出498 bp的目的片段,Western-blot可见54 kDa的特异性条带,而COS-7/pcDNA3.1细胞上述各项检测结果均为阴性。结论成功构建GK基因真核表达载体pcDNA3.1-GKZ1,并于COS-7细胞中成功转录与表达。
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