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《微生物学通报》 2017年09期
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重组瑞替普酶在毕赤酵母中的表达

张旦旦  窦文芳  赵军  史劲松  许正宏  
【摘要】:【目的】瑞替普酶(重组组织纤溶酶原激活物,rt PA)被认为是第三代安全有效的溶栓剂,以p PIC9K为载体,以3种不同表型的毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主,探索适合rt PA分泌型表达的最佳体系。【方法】以质粒p ET28a-rt PA为模板,设计特异性引物,PCR扩增目的基因rt PA,插入分泌型表达载体p PIC9K中,获得重组表达质粒p PIC9K-rt PA。重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化后,电击转化至3种不同表型的P.pastoris(GS115、SMD1168、KM71)中进行组成型表达;重组表达体系进行甲醇诱导表达,对产物进行Western blot鉴定,并采用纤维蛋白平板溶圈法测定其活性。【结果】重组蛋白分子量约为43 k D;rt PA-GS115和rt PA-KM71均在39 k D处有特异性条带,且前者在32 k D处有轻微降解条带,而后者并无此现象;rt PA-SMD1168无降解现象,且rt PA-SMD1168比活性较rt PA-GS115高27%;rt PA-KM71表达量和活性均为最低。【结论】从重组蛋白生物活性出发,P.pastoris SD1168可作为rt PA的最佳表达体系,在控制宿主蛋白酶活性、减少产物降解的前提下,P.pastoris GS115也是rt PA表达的优选体系。
【作者单位】江南大学药学院制药工程研究室;江南大学生物工程学院;
【基金】:国家高技术研究发展计划(863计划)项目(No.2012AA022204C)~~
【分类号】:Q78;R915
【正文快照】:
血栓性疾病,如急性心肌梗塞(AMI)、深静脉血栓、脑血栓等,发病率很高且呈逐年上升的趋势,此类疾病具有很高的致残率和致死率,而溶栓治疗是主要疗法。组织纤溶酶原激活物(Tissuetype plasmenogen activator,t PA)又称血管纤溶酶原激活物或外激活物,是由血管内皮细胞产生的一种

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