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《山西医药杂志》 2017年03期
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双酶切和无缝克隆方法构建HCV CORE表达载体的比较

王敏敏  赵婕  常亚磊  陈浩男  陈思思  宋静  魏建宏  
【摘要】:目的以PLVX-IRES-ZsGreen1为载体骨架,通过双酶切方法和无缝克隆方法构建HCV CORE真核表达载体,比较2种不同载体构建方法的优缺点,以期为合理选择载体构建方法提供依据。方法双酶切方法使用BamHⅠ和EcoRⅠ两种限制性内切酶分别酶切PLVX-IRES-ZsGreen1和目的基因聚合酶链反应(PCR)片段,形成带有相同黏性末端的线性载体片段和PCR片段,然后利用T4DNA连接酶连接,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,转化菌涂在含氨苄青霉素的固体培养基中进行阳性单克隆筛选并测序。无缝克隆方法利用同源重组的原理,通过重组酶将靶基因PCR片段和经XhoⅠ酶切的PLVX-IRES-ZsGreen1线性载体重组连接,连接产物同样转化入感受态细胞中,转化菌涂布含氨苄青霉素的固体培养基平板进行阳性克隆筛选并测序。结果跟双酶切载体构建方法比较,同源重组法步骤相对简单,可以更高效快速地构建载体,但是假阳性率略高。结论同源重组法可更高效地构建载体,但假阳性率高。
【作者单位】山西医科大学汾阳学院基础医学部;山西医科大学汾阳学院医学检验系;
【基金】:山西省大学生创新创业训练计划项目(2014052)
【分类号】:Q78
【正文快照】:
分子克隆是基因重组和蛋白基因工程表达研究中必不可少的手段之一,是分子生物学中的一种基本的操作方法[1,2]。而通过双酶切来构建载体是其中常用的一种方法,这种方法利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理,用2种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有黏性

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