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《中国生物化学与分子生物学报》 2018年12期
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人粪便宏基因组α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质及其对芦丁的生物转化

史云璐  李彬春  李艳琴  
【摘要】:HFM-rha78是本实验室从健康人体粪便宏基因组DNA中获得的新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。该基因全长2 166 bp,编码蛋白质分子质量为83 kD,等电点5. 58,其二级结构以α螺旋和无规卷曲为主,整体表现出亲水性,其氨基酸序列与GenBank收录的序列一致性仅为48%。系统进化树表明,该酶被分类至亚家族Ⅱ,其催化广义酸和广义碱均为谷氨酸,催化残基高度保守。为明确其酶学性质,以对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷(p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside,pNPR)为底物,通过紫外-可见分光光度法测定产物对硝基苯酚的生成量,得到HFM-Rha78的最适反应温度为50℃,最适pH为6. 5,且在30~46℃下保温30 min,不影响活力。为初步研究其对芦丁的水解能力,首先对HFM-Rha78的有机溶剂耐受性进行了研究。结果表明,该酶能普遍耐受1%的有机溶剂,甚至1%~5%的异丙醇和1%的β-巯基乙醇,有提高其活性的能力。当DMSO浓度为10%时,仍能保持79%的酶活性。HFM-Rha78对底物pNPR的V_(max)为129. 9μmol min-1mg~(-1),HFM-Rha78的KM较大,为26. 0 mmol L~(-1)。转换数k_(cat)为185. 1 s~(-1),催化效率k_(cat)/KM为7. 1×103s~(-1)mol~(-1)L。采用高效液相色谱仪检测HFM-Rha78水解芦丁的能力。结果表明,37℃条件下,随着酶浓度和水解时间增加,芦丁转化率增大。反应10 h时,芦丁转化率达41. 8%。本研究获得了HFM-Rha78的最适反应条件,并确定其可特异性生物转化芦丁为异槲皮素。

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