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《江苏农业学报》 2017年01期
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鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用

徐重新  张霄  张存政  刘媛  仲建锋  董飒  胡晓丹  林曼曼  刘贤金  
【摘要】:构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入E.coli TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库。以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性。以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性。经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上。经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因。电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×10~8。随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性。以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强。
【作者单位】江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室;
【关键词】噬菌体展示库 单链抗体 重叠延伸PCR 噬菌粒载体 Bt毒素
【基金】:国家自然科学基金项目(31630061、31371778) 省部共建国家重点实验室培育基地——江苏省食品质量安全重点实验室自主研究课题(49114063201604、49114063201608) 江苏省农业科学院院基金项目(6111676)
【分类号】:Q78
【正文快照】:
quences and add to VH and VL respectively.Splicing VH-Linker and Linker-VL sequences by overlapping extension PCR(SOE-PCR)to a whole Sc Fv.Then clone Sc Fv into the p CANTAB-5E phagemid vectors,after being digested by restrictionendonuclease(Not I、Sfi I

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