微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达

张桂芝武彬井庆川刘辉石天虹刘雪兰魏祥法刘瑞亭

【摘要】：以微小毛霉基因组为模板,PCR扩增得到凝乳酶结构基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,连接穿梭载体pPIC9K,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并测定其核苷酸序列。测序结果证实扩增得到的片段为凝乳酶基因,与GenBank报道的序列(No.X06219)存在6对碱基的区别。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,构建重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-m cp,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m l、具有多拷贝基因的整合重组菌pPIC9K-m cp-03。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得该重组菌凝乳酶活力为5 660 U/m l,比微小毛霉发酵液提高50多倍,且发酵液电泳结果表明毕赤酵母自身分泌的蛋白很少,只能看到约38.5 ku的凝乳酶蛋白条带。

【作者单位】：山东省农业科学院家禽研究所;
【关键词】： 凝乳酶 毕赤酵母 克隆表达
【基金】：山东省农业科学院创新基金项目(编号2006YCX025)
【分类号】：Q786
【正文快照】：

凝乳酶(EC3·4·23·4)一般也称rennin,是一种酸性蛋白酶,专一性裂解对牛奶具有稳定作用的κ-酪蛋白的Phe105-Met106键[1],生成para-κ-酪蛋白和巨肽的蛋白。para-κ-酪蛋白不能稳定分子结构,而使不溶的蛋白质沉淀凝结[2]。凝乳酶在食品、医药、工业等行业应用广泛,尤其是干

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前2条

1	张桂芝;武彬;井庆川;石天虹;刘雪兰;魏祥法;刘瑞亭;史勇;;酸碱度和温度对重组凝乳酶活力的影响[J];饲料研究;2010年02期
2	张健;张莉;李玉秋;杨贞耐;;重组毕赤酵母产凝乳酶发酵条件研究[J];中国酿造;2011年10期

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前2条

1	张健;重组毕赤酵母发酵制取凝乳酶及其在干酪加工中的应用[D];吉林农业大学;2011年
2	路博;酸性蛋白酶基因在毕赤酵母及黑曲霉中的表达[D];东北农业大学;2010年

	【参考文献】
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前8条

1	聂东宋,梁宋平,李敏;外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略[J];吉首大学学报(自然科学版);2001年03期
2	孙海蛟;吕敏;黄艾祥;;我国干酪凝乳酶研究及应用现状[J];中国乳业;2008年05期
3	张富新 ,顾熟琴;不同凝乳酶在干酪生产中应用效果的研究[J];食品工业科技;2003年07期
4	郭光远,姜成林,马俊;微生物凝乳酶的研究Ⅰ.菌株的筛选、发酵、制备及毒性[J];微生物学通报;1988年05期
5	周小玲,沈微,饶志明,王正祥,诸葛健;一种快速提取真菌染色体DNA的方法[J];微生物学通报;2004年04期
6	钱世钩;张纯青;矫庆华;田开荣;孟广震;;微小毛霉凝乳酶的纯化和性质[J];微生物学报;1989年04期
7	戴秀玉,王韫恂,周坚,李绍极;毕赤氏酵母P_(AOX2)突变体序列分析[J];微生物学报;1999年06期
8	赵秀玲;;6种凝乳酶在牛奶干酪生产中的应用效果研究[J];资源开发与市场;2009年03期

	【共引文献】
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前10条

1	吴瑞娟;金卫根;饶军;;小菇一种Mycena sp.的DNA提取及测序[J];安徽农业科学;2008年03期
2	林芳栋;蒋珍菊;曹蕊;;物质依数性在掺水原料乳质量检测中的应用研究[J];安徽农业科学;2011年10期
3	李冬琳;侯军;林晓民;陈根强;崔晓琦;;涡旋法提取白僵菌孢子DNA技术研究[J];现代农业科技;2012年09期
4	任文亚;高红亮;常忠义;王雪梅;;抗坏血酸与金属离子在光照引起的牛奶风味劣化中的作用[J];安徽农业大学学报;2009年02期
5	徐丽丽;侯冬岩;回瑞华;刘丽君;;乳制品中蛋白质含量的测定[J];鞍山师范学院学报;2006年04期
6	回瑞华;侯冬岩;刘晓媛;刁全平;;三聚氰胺与问题奶粉[J];鞍山师范学院学报;2008年06期
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9	张芳;李红旭;;影响牛乳酪蛋白分离因素的研究[J];保鲜与加工;2006年03期
10	曹连忠;汤晖;张利平;;红酵母RT-1核酸提取方法的比较及基因crtYB和crtE扩增[J];河北农业大学学报;2010年02期

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1	郦韬珉;李涛;;酸奶杀菌与凝固过程中的物理化学变化[A];首届中国奶业大会论文集(下册)[C];2010年
2	张丽红;王景会;王昕;郑丽;杨贞耐;;表达凝乳酶的重组毕赤酵母发酵条件优化及部分酶学特性研究[A];低碳经济与科学发展——吉林省第六届科学技术学术年会论文集[C];2010年
3	韩明臣;冯莲荣;王占斌;;绿色木霉(Trichoderma viride Pers．ex Fr．)几丁质酶基因克隆[A];中国植物病理学会2007年学术年会论文集[C];2007年

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2	王森;扁桃胶多糖组分鉴定与加工特性变化规律研究[D];中南林业科技大学;2010年
3	林林;生物组织光学断层成像与光学参数提取方法研究[D];暨南大学;2011年
4	张志国;新型凝乳酶产生菌Quambalaria cyanescens的鉴定及酶学性质和应用研究[D];南京农业大学;2011年
5	杜中军;苹果多酚HPLC测定方法及碱性磷酸酯酶在毕赤酵母中表达体系的建立[D];山东农业大学;2002年
6	张伟;利用生物技术开发一种新乳糖酶及其高效生产途径[D];中国农业科学院;2002年
7	张富新;羔羊凝乳酶提取分离及特性的研究[D];陕西师范大学;2003年
8	李敏;高甜度monellin基因和透明颤菌血红蛋白基因在毕赤酵母中的表达[D];中国农业科学院;2003年
9	余瑛;人酸性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌和酵母中的表达、纯化及其特性分析[D];重庆大学;2003年
10	彭远义;植酸酶产生菌的选育及高表达工程菌的构建研究[D];西南农业大学;2004年

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1	赵正涛;液态乳体系稳定性机理的初步研究[D];山东农业大学;2010年
2	史瑜婷;酶法降低β—乳球蛋白含量的研究[D];安徽农业大学;2010年
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4	闫斌斌;原料乳掺假、抗生素残留快速检测方法研究[D];新疆农业大学;2010年
5	宋欣;花生乳牛乳混合干酪加工工艺研究[D];河北农业大学;2011年
6	王慧;应用双质粒体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母GS115中表达量的初步研究[D];江南大学;2011年
7	赵春燕;奶粉包装保质机理及保质期预测[D];江南大学;2011年
8	陈钊;二氧化氯对真菌杀灭机理及果蔬保鲜效果的研究[D];山东农业大学;2011年
9	郑丽;基因工程凝乳酶的发酵制取及应用研究[D];吉林大学;2011年
10	邵淑娟;产凝乳酶霉菌菌种的诱变选育及其酶学性质研究[D];吉林大学;2011年

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1	杨丰科;姜萍;李思东;王守满;;丝状真菌基因工程进展[J];氨基酸和生物资源;2009年01期
2	张富新,杨宝进;植物凝乳酶凝乳特性的研究[J];黄牛杂志;1997年01期
3	曹亚彬,郭丽姝,王惠民;饲料用酸性蛋白酶研究[J];饲料工业;2000年10期
4	刘华;李敏;;基因重组蛋白质的表达系统与分离纯化研究进展[J];福建师范大学学报(自然科学版);2007年01期
5	陈汉春;Rad51同系物与DNA重组修复[J];国外医学.遗传学分册;2003年04期
6	郭美锦,庄英萍,吴康华,储炬,张嗣良;基因工程菌Pichia pastoris高密度发酵表达重组人血清白蛋白[J];华东理工大学学报;2002年01期
7	刘西梅;安立国;乔宪凤;唐青海;华文君;;毕赤酵母表达猪胃蛋白酶的研究[J];华中师范大学学报(自然科学版);2008年03期
8	李永泉;羊毛生物整理复合酶高产菌的激光选育[J];菌物系统;2001年02期
9	王政逸,王秋华,李德葆;根癌土壤杆菌介导的丝状真菌转化[J];菌物系统;2003年02期
10	李刚,王强,刘秋云,李宝健;利用PEG法建立药用真菌灵芝的转化系统[J];菌物学报;2004年02期

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1	张文明;洪静;孙天玮;黄国团;梁军;王大力;林殿海;;长链人胰岛素样生长因子-1在毕赤酵母中表达条件的优化[J];中国生物制品学杂志;2012年04期

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1	陈鸿图;高产中性蛋白酶菌株选育及产酶特性研究[D];华南理工大学;2012年
2	侯文婷;产苯丙氨酸解氨酶菌株筛选、重组菌构建及发酵工艺研究[D];江南大学;2012年

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前10条

1	张富新,杨宝进;植物凝乳酶凝乳特性的研究[J];黄牛杂志;1997年01期
2	王洪海,高卜渝,陈佩丽,董灵,李育阳;酵母表达基因工程产物不均一性分析及其对策[J];中国科学(B辑化学生命科学地学);1994年12期
3	姚斌,张春义,王建华,范云六;高效表达具有生物学活性的植酸酶的毕赤酵母[J];中国科学C辑:生命科学;1998年03期
4	崔福绵;那安;马建华;张树政;;不同真菌纤维素酶一些生物化学性质的比较[J];真菌学报;1984年01期
5	张富新;不同因素对羔羊皱胃酶凝乳活性的影响[J];农业工程学报;2001年04期
6	薛彦斌;;树木凝乳酶的研究与应用[J];中国乳品工业;1990年03期
7	顾瑞霞;申戈;;凝乳酶及其代用品[J];中国乳品工业;1991年01期
8	刘文宗,蒋敏,何晓霞,江信红,梁仕银;干酪凝乳酶代用品研究[J];四川畜牧兽医学院学报;2001年02期
9	唐南筠,霍克克,李育阳;乳酸克鲁维酵母高拷贝整合载体的构建及应用[J];生物化学与生物物理学报;1996年05期
10	赵翔,霍克克,李育阳;毕赤酵母的密码子用法分析[J];生物工程学报;2000年03期

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1	代景泉;生姜蛋白酶的分离纯化及其部分特性的研究[D];山东农业大学;2002年

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3	朱艳平;王玉;徐慧;郭霄峰;;猪血清白蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达[J];中国生物制品学杂志;2010年02期
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7	王玮;张志东;茆军;王涛;谢玉清;唐琦勇;;高温中性蛋白酶基因的克隆及毕赤酵母表达研究[J];新疆农业科学;2009年03期
8	吴学敏;单颖;李华;卢颖;佟伟;张轶博;李会;;pGAPZαA/HD5酵母表达载体的构建[J];中国现代医学杂志;2009年18期
9	张桂芝;武彬;井庆川;刘辉;石天虹;刘雪兰;魏祥法;刘瑞亭;;微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达[J];山东农业科学;2009年11期
10	蔡累;宋爱玲;岳燕;王伟华;秦鑫;张英起;李志奎;;小鼠sIL-13Rα2基因的克隆及在毕赤酵母中的表达[J];中国生物制品学杂志;2009年01期

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1	陈玉飞;祁克宗;彭开松;涂健;;鸡β-防御素-8 cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十六次学术研讨会、中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十五次学术研讨会论文集[C];2009年
2	仝光杰;楼觉人;;HPV52 L1蛋白在毕赤酵母中的优化表达[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
3	金光泽;段作营;张莲芬;金坚;李华钟;;重组融合人血清白蛋白/人白介素-2 C125A突变体在毕赤酵母中的表达[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
4	崔栩;曹云鹤;;两种β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达研究[A];第六次全国饲料营养学术研讨会论文集[C];2010年
5	周宇飞;袁汉英;吕红;;人超氧化物歧化酶-胸腺素α1在毕赤酵母中的表达、纯化与活性检测[A];2012年中国青年遗传学家论坛会议文集[C];2012年
6	傅小强;吴少庭;黄汉菊;刘洪波;;结核杆菌ESAT-6基因在毕赤酵母中表达及其鉴定[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年
7	王宏伟;金宁一;;抗HIV—1gp120单链抗体基因的克隆及其在毕赤酵母系统中的表达[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年
8	汤丹;刘松财;史勇;李莉;张英;郝林琳;;甜味蛋白Brazzein在毕赤酵母中的表达[A];全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
9	苏曼曼;许天敏;王毅;宿晓云;颜炜群;;重组人载脂蛋白E3在毕赤酵母中的表达与鉴定[A];吉林省第六届生命科学大型学术报告会论文集[C];2008年
10	廖娟;王红宁;田浪;阳泰;张毅;;禽传染性支气管炎病毒M基因在毕赤酵母中表达与蛋白反应活性检测[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2008年

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1	;空调竞争：莫克隆彩电[N];厂长经理日报;2001年
2	;克隆联想PC[N];中国经营报;2002年
3	本报记者赵伟;奇瑞：克隆年代的另类[N];中国质量报;2001年
4	鲁钟鸣;要创新不要克隆[N];新华每日电讯;2001年
5	本报记者马莹;在中国克隆国际名牌展览[N];中国贸易报;2001年
6	本报记者侯朝晖;“克隆”人体赚！[N];厂长经理日报;2001年
7	经济学家温铁军○本报记者杨晓平;无法克隆的现代化[N];中华工商时报;2002年
8	本报记者姚福泰;中国会克隆国际“6+3”的格局吗[N];中国汽车报;2002年
9	记者姚备;复星重整克隆公司股权[N];中国证券报;2000年
10	本报记者陈晓红;任鸣不愿克隆“人艺风格”[N];中国艺术报;2000年

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1	黄志立;纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达[D];华南理工大学;2001年
2	王严;曲霉植酸酶基因的克隆及其表达研究[D];大连理工大学;2007年
3	卢忠民;IL-18 RGD模体的构建及生物活性的研究[D];大连医科大学;2005年
4	刘堰;重组人白介素-2（IL—2）突变体克隆及在巴斯德毕赤酵母系统中的表达与纯化[D];重庆大学;2002年
5	马杰;人HSP70在毕赤酵母中的表达鉴定及大规模发酵和纯化工艺研究[D];吉林大学;2005年
6	万榕;蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂（sv-cystatin）抗黑色素瘤细胞侵袭与转移的作用[D];福建医科大学;2005年
7	杨莉莉;重组牛胰蛋白酶抑制剂的研究[D];吉林大学;2006年
8	王海燕;荧光假单孢菌脂肪酶基因的克隆、改造及其在毕赤酵母中的表达[D];中国农业科学院;2006年
9	陈伟莉;重组人TRAIL的制备和抗肿瘤作用的研究[D];吉林大学;2007年
10	吴丽娟;重组人A20的分子设计及酵母表达研究[D];重庆医科大学;2004年

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1	李淑娟;黑曲霉乳糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[D];河北农业大学;2007年
2	李琦;甘油单-二酰酯脂肪酶基因的克隆和表达[D];北京化工大学;2005年
3	罗琳;抗CD3人鼠嵌合抗体的克隆及其在毕赤酵母中的表达[D];吉林大学;2006年
4	孙楠;人Bikunin结构域Ⅱ的克隆及在毕赤酵母中的表达[D];吉林大学;2008年
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6	相代荣;重组人肝再生增强因子的克隆和在毕赤酵母中初步表达[D];浙江大学;2009年
7	安立国;猪胃蛋白酶原A基因的克隆、密码子优化及在毕赤酵母中表达的研究[D];西北农林科技大学;2007年
8	孔航天;蚓激酶基因在原核和毕赤酵母中的表达[D];吉林大学;2008年
9	孙向宇;Exendin-4（9-39）毕赤酵母工程菌的克隆及发酵研究[D];吉林大学;2008年
10	石磊;重组人KGF的cDNA克隆及在毕赤酵母中的表达[D];吉林大学;2006年

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