| | | | | 绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达 | | | 林毅;林奇英;谢联辉 | | | 核糖体失活蛋白 (ribosome inactivatingprotein ,RIP)具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值 ,以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值。它是一种多活性的物质 ,不同RIP具有各自独特的功能 ,其潜在活性还在不断发现之中。葫芦科 (Cucurbitaceae)植物大多药食同源 ,其中蕴涵着极其多样的RIP ,但多数已知的RIP其基因尚未被克隆 ,而目前仍无一套快速筛选RIP新基因的方法。葫芦科中的绞股蓝 (Gynostemmapentaphyllum)具有抗癌和抗衰老等特殊功效 ,其中的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道 ,但其活性蛋白成分未见报道。为此 ,本研究开展绞股蓝RIP的分离纯化、基因克隆、原核表达以及转基因植物研究。率先对绞股蓝活性蛋白成分进行研究 ,从中分离到一种新的核糖体失活蛋白 (绞股蓝毒蛋白 ,Gy nostemmin)。它具有很高的抗TMV活性。其分子量约为 2 7kDa。测得其N -端 19个氨基酸序列 :DIN FSLAGADGQTYNTFIA ,与其它植物RIP的同源性为 10 % - 73% ,与葫芦科RIP的同源性为 37% -73%。根据葫芦科RIP上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物对LY1/LY2 ,对基因组DNA进行PCR扩增 ,首次建立了RIP新基因快速筛选体系。从冬瓜和南瓜中分别获得了 1个和 5个RIP新基因 ,长度为 4 0 8bp ,编码 136aa ,与其它葫芦科RIP对应区段的
【作者单位】：福建农林大学植物病毒研究所;福建农林大学植物病毒研究所;福建农林大学植物病毒研究所 福州;350002博士研究生;福州;350002博士生导师;福州;350002博士生导师
【关键词】：绞股蓝;核糖体失活蛋白;分离纯化;分子克隆;原核表达;转基因烟草
【分类号】：Q943.2
【DOI】：cnki:ISSN:1672-416X.0.2003-Z1-032
【正文快照】：
绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达@林毅$福建农林大学植物病毒研究所!福州,350002博士研究生
@林奇英$福建农林大学植物病毒研究所!福州,350002博士生导师
@谢联辉$福建农林大学植物病毒研究所!福州,350002博士生导师绞股蓝;;核糖体失活蛋白;;分离纯化;;分子克 | | |
| | |  推荐 下载CAJ全文  下载PDF全文 | | | CAJViewer7.0阅读器支持所有CNKI文件格式，AdobeReader仅支持PDF格式 | | | | Purification, Cloning and Expression of Ribosome Inactivating Protein from Gynostemma pentaphyllum | | | Ph.D.Candidate: Lin Yi Supervisor: Prof. Lin Qiying & Prof. Xie Lianhui Institute of Plant Virology;Fujian Agriculture and Forestry University;Fuzhou;350002 | | | Many Cucurbitaceae plants were known to be Chinese medicine herbs and contain ribosome-inactivating proteins (RIP), a group of toxic proteins that have been proposed and demonstrated to play potential use as toxins in the therapy of a variety of human tumors and viruses including HIV. And much interest has been devoted to construct RIP transgenic crops for the protection from pathogen infection. RIP is a multi-activity protein, and different RIPs exhibit unique functions. Thus, a rapid screening method for novel RIP genes is in urgent need. Gynostemma pentaphyllum, a member of Cucurbitaceae family, is a kind of herb with great value of Chinese medicine and widely manufactured for health care in China. However, there were no reports on active proteins from G.pentaphyllum. A novel RIP named Gynostemmin (27 kDa) was purified from the leaves and stems of G.pentaphyllum. It showed excellent anti-TMV activity. And the N-terminal 19 amino acid residues are 'DINFSLAGADGQTYN TFIA' (accession number P83206 in SWISS-PROT), which shared 10%-73% identities to other RIPs from plants and 37%-73% to other RIPs from Cucurbitaceae. Six novel RIP gene fragments (408 bp), 1 from Benincasa hispida and 5 from Cucurbita moschata, were isolated from Cucurbitaceae by applying a PCR strategy termed 'conserved regions cloning' using a pair of two degenerated primers deduced from the two blocks with strong amino acid conservation locating at the position 66-73 and 195-202 referring to the mature TCS sequence. Compared with the corresponding regions of 19 RIPs from Cucurbitaceae, 29 completely conserved amino acid residues were revealed, and 7 of them were also identical within other type I and type II RIPs from other families, including the proposed active amino acid residues (Glu 160, Arg 163, and W 192 in TCS). The partial coding region of Gynostemmin (609 bp, accession number AY075115 in GenBank) was cloned from the genomic DNA by using a pair of degenerated primers based on its N-terminal amino acid sequence and the highly conserved amino acid residues in the downstream of most RIPs from Cucurbitaceae. 5'RACE extended 33 bp upstream and revealed a signal peptide with 23 amino acid residues: MRVARFCTVVAILLYFGFHIAEC. Five cDNA sequences with 3'UTR were identified by 3'RACE, the secondary structures of 3'UTR between GynostemminI and GynostemminII～V were remarkably different. And another 4 cDNA and 2 DNA sequences were obtained. They shared high homologies both at nucleotide acid level and amino acid level. According to the 6 bp or 87 bp deletion, the RIP multigene family from G.pentaphyllum could be divided into four groups. Group 1, including Gynostemmin II, GP609, and CX8405A, with the 6 bp deletion at the position of 535-540, encoding 275 aa; Group 2, including DNA-750 and CX820, with the 87 bp deletion at the position of 122-208, encoding 248 aa; Group 3, including 5RACE and DNA-8001, without the 87 bp deletion,and the 6 bp deletion were uncertain because of the incomplete sequence;And group 4, including GynostemminI, III～V, EMUZW, and RHXJB, without the deletion of both 87 bp and 6 bp, encoding 277 aa. Bioinformatic analysis were performed to prepro-GynostemminI on the base composition, codon preference, amino acid composition, pI value, molecular weight, secondary structure, prosite scan, prediction of protein localization sites, blast the Arabidopsis thaliana genome, and 3D structure modeling. GST-fusion and native RIP from G.pentaphyllum were expressed in E.coli by inserting the GP609 and RHXJB into the pGEX-2T vector, and DNA-8001 into the pET-5a vector, respectively. The native expressed product from E.coli BL21(DE3) strain, however, showed weak activity against TMV. GP609 and ZWEMU were inserted into pEmu-mcs-N, an expression vector for monocotyledon. And RHXJB was inserted into pKYLX71∶35S2, a suitable expression vector for dicotyledon, then introduced into Agrobacterium LBA4404 by triparental mating. Transgenic tobacco K-326 infected by the recombinant Agrobacterium was demonstrated by PCR, sequen
【Keyword】：Gynostemma pentaphyllum, Ribosome-inactivating protein, Purification, Molecular cloning,Expression, Transgenic tobacco |
| | | | | | 1 | 李纯,周立人; 激素对绞股蓝愈伤组织过氧化物酶及皂甙含量的影响 [J];安徽农业大学学报(自然科学版); 1998年04期 | | 2 | 诸平; 《宝鸡文理学院学报》（自然科学版）引文分析 [J];宝鸡文理学院学报(自然科学版); 1996年02期 | | 3 | 甘赞琼,李锋,韦霄,黄正福; 绞股蓝繁殖试验研究 [J];广西植物; 1993年01期 | | 4 | 王庆亚,张守栋,孙建云,李扬汉; 绞股蓝果实的发育解剖学研究 [J];广西植物; 2003年04期 | | 5 | 郭锡勇,彭小冰,潘定举,刘贞敏; 薄层扫描法测定引种绞股蓝中人参二醇的含量 [J];贵阳中医学院学报; 1998年03期 | | 6 | 李纯,孟洁; 安徽省绞股蓝资源调查及质量评价 [J];安徽农学通报; 1997年03期 | | 7 | 项艳,章力干,李纯,郭宁; 激素对组织培养绞股蓝生长及酶活性的影响 [J];安徽农学通报; 1999年03期 | | 8 | 李新凤，邓世林，郭小林，周平; 原子吸收光谱法测定绞股蓝中20种微量元素 [J];分析试验室; 1995年03期 | | 9 | 叶能干; 绞股蓝的形态解剖研究 Ⅱ.绞股蓝生殖器官的解剖特征 [J];贵州农业科学; 1991年05期 | | 10 | 周广生，熊志学，赵开飞，张彪; 绞股蓝作为肉鸡饲料添加剂的研究 [J];当代畜牧; 1995年04期 |
|
| | | | 1 | 林毅,吴祖建,谢联辉,林奇英; 抗病虫基因新资源:绞股蓝核糖体失活蛋白基因[J]; 分子植物育种; 2003年Z1期; 187-189 | | 2 | 林毅,陈国强,吴祖建,林奇英,谢联辉; 绞股蓝抗TMV蛋白的分离及编码基因的序列分析[J]; 农业生物技术学报; 2003年04期; 39-43 | | 3 | 林毅,陈国强,吴祖建,林奇英,谢联辉; 快速获得葫芦科核糖体失活蛋白新基因[J]; 农业生物技术学报; 2004年01期; 9-13 | | 4 | 魏明卉,魏明旭,刘征,罗艳蕊; 丝瓜和苦瓜核糖体失活蛋白的比较研究[J]; 河南师范大学学报(自然科学版); 2002年01期; 120-123 | | 5 | 付鸣佳,吴祖建,林奇英,谢联辉; 美洲商陆抗病毒蛋白研究进展[J]; 生物技术通讯; 2002年01期; 66-71 | | 6 | 程雪,胡进耀,苏智先; 丝瓜核糖体失活蛋白的研究进展综述[J]; 西华师范大学学报(自然科学版); 2004年02期; 86-88+97 | | 7 | 傅明辉,田洁; 苦瓜籽核糖体失活蛋白的分离纯化及抗氧化活性的研究[J]; 中国生化药物杂志; 2002年03期; 28-30 | | 8 | 林毅,陈国强,吴祖建,谢联辉,林奇英; C-末端缺失和完整的绞股蓝核糖体失活蛋白在大肠杆菌中的表达[J]; 江西农业大学学报(自然科学版); 2004年04期; 119-121 | | 9 | 魏明卉,李英,刘征; 核糖体失活蛋白及研究进展[J]; 南都学坛; 2001年06期; 67-70 | | 10 | 林峻凯,陈明晃,谢捷明,赵蓉,叶晓明,石小莉,王梓壬; 八棱丝瓜籽核糖体失活蛋白的分离纯化及其生化性质[J]; 中国生物化学与分子生物学报; 2002年05期; 89-93 |
|
| | | | | | 1 | 斯越秀,刘望夷,钱凯先; 侧柏籽核糖体失活蛋白的分离及作用机制研究 [J];浙江大学学报(工学版); 2005年03期; 109-112 | | 2 | 袁燕,毛宇,黄晓麒,戴晓畅; 核糖体失活蛋白研究新进展 [J];天然产物研究与开发; 2007年01期; 172-177 | | 3 | 郑永唐,贲昆龙; 抗人体艾滋病毒的核糖体失活蛋白 [J];大自然探索; 1997年02期; 63-67 | | 4 | 刘望夷,张劲松,刘仁水,何文君,凌俊; 核糖体失活蛋白及核糖体RNA结构与功能的研究 [J];中国科技奖励; 2006年10期; 45 | | 5 | 唐有祺,黄其辰; 两种核糖体失活蛋白的活性中心几何构型和反应机理的结晶学研究 [J];自然科学进展; 1994年05期; 13-21 | | 6 | 叶能干; 绞股蓝拾零 [J];植物分类学报; 1994年04期; 51 | | 7 | 陈红，华陵，王悦，颜茂恭，董贻诚，余明琨，姚启智; 单链核糖体失活蛋白的核糖核酸酶活性 [J];生物化学与生物物理进展; 1996年05期; 453-456 | | 8 | 谈绞股蓝兼答读者问 [J];中老年保健; 2002年11期; 49 | | 9 | 覃章铮; 绞股蓝开发利用的几个问题 [J];植物杂志; 1994年05期; 22-23 | | 10 | 侯法建,刘望夷; 植物核糖体失活蛋白的研究进展 [J];世界科技研究与发展; 2000年05期; 73-77 |
|
| | | | | | 1 | 林毅,谢联辉,林奇英; 绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆、表达及转基因植物 [A];中国细胞生物学学会第八届会员代表大会暨学术大会论文摘要集 [C]; 2003年 | | 2 | 林毅,陈国强,吴祖建,谢联辉,林奇英; 绞股蓝核糖体失活蛋白的信号肽和上游非编码区 [A];第三次全国植物病毒和病毒防治学术研讨会论文集 [C]; 2003年 | | 3 | 刘仁水,魏国清,刘望夷; Ⅱ型核糖体失活蛋白cinnamomin在种子细胞中功能的研究 [A];中国毒理学会生物毒素毒理专业委员会第4次、中国生物化学与分子生物学会毒素专业组第5次学术研讨会论文摘要 [C]; 2001年 | | 4 | 刘仁水,魏国清,刘望夷; Ⅱ型核糖体失活蛋白cinnamomin在种子细胞中功能的研究 [A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集 [C]; 2001年 | | 5 | 侯法建,刘望夷; Ⅱ型核糖体失活蛋白在植物细胞内的一个可能的降解代谢途径 [A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集 [C]; 2001年 | | 6 | 侯法建,刘望夷; Ⅱ型核糖体失活蛋白在植物细胞内的一个可能的降解代谢途径 [A];中国毒理学会生物毒素毒理专业委员会第4次、中国生物化学与分子生物学会毒素专业组第5次学术研讨会论文摘要 [C]; 2001年 | | 7 | 林峻凯,谢捷明,陈明晃,赵蓉,叶晓明,石小莉; 一种新的核糖体失活蛋白——南瓜蛋白的纯化、结晶和部分性质测定 [A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集 [C]; 2001年 | | 8 | ANTIFUNGAL ACTIVITY OF THE RIBOSOME-INACTIVATING PROTEINS MOMORDIN, SAPORIN AND LUFFIN [A];中国菌物学会第三届会员代表大会暨全国第六届菌物学学术讨论会论文集 [C]; 2003年 | | 9 | 阮小蕾,李华平; 几种植物核糖体失活蛋白新基因的克隆和序列分析 [A];中国植物病理学会2004年学术年会论文集 [C]; 2004年 | | 10 | 刘仁水,杨家华,刘望夷; 一种低等藻类来源的核糖体失活蛋白的分离纯化及性质研究 [A];中国毒理学会生物毒素毒理专业委员会第4次、中国生物化学与分子生物学会毒素专业组第5次学术研讨会论文摘要 [C]; 2001年 |
|
|
|